血小板功能试验的应用进展

刘振玲

天津市蓟州区人民医院检验科 301900

随着我国人口老龄化的加剧，血栓性疾病已成为常见病和多发病,其发病率呈逐年上涨的趋势。抗血小板药物在治疗血栓性疾病中发挥着重要的作用,其疗效是肯定的，但在使用过程中存在着显著的个体差异，伴随着一定的出血风险。临床希望实验室能够为抗血小板治疗提供可靠的试验数据，确保治疗的安全性和有效性。现有的血小板功能试验对抗血小板治疗的监测具有重要的指导意义,但存在着一定的局限性。本文对目前临床使用的血小板功能的检测方法做一简单介绍，分析其检测结果对临床抗血小板治疗的指导意义。

1 抗血小板药物分类

抗血小板药物是一类有效抑制血液中血小板释放、聚集和黏附功能的药物，能够阻止血小板聚集，预防和治疗血栓性疾病[1]。根据药物作用靶点不同,在临床上广泛应用的抗血小板药物主要分为四大类：(1)环氧化酶抑制剂，其主要通过抑制血小板PGH2 合成酶而阻断TXA2 的生成，进而阻止血小板的聚集，预防血栓形成,代表药物为阿司匹林[2]。(2)P2Y12受体拮抗剂，其主要通过抑制血小板膜P2Y12受体的表达、结合及其活性，从而抑制GPⅡb/Ⅲa 与纤维蛋白原的结合，通过活化血小板腺苷酸环化酶，升高血小板内环磷酸腺苷(cAMP)水平而抑制血小板的聚集功能,代表药物为氯吡格雷、普拉格雷、替格瑞洛等[3-4]。(3)血小板表面GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂能够抑制血小板GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原的结合，血小板不能发生交联，阻止血小板聚集,代表药物主要阿昔单抗、替罗非班、依替非巴肽等[5-6]。(4)磷酸二酯酶抑制剂，通过激活血小板环磷腺苷(如腺苷、前列腺素)，或抑制磷酸二酯酶对cAMP的降解，从而增高血小板内cAMP浓度,抑制血小板的第一相聚集和第二相聚集,代表药物主要有西洛他唑、双嘧达莫等[6-8]。抗血小板药监测试验见表1。

表1 抗血小板药物监测试验

2 血小板功能检测试验

2.1 血小板聚集试验(PAgT) 血小板聚集试验按工作原理分为光学比浊法(Light transmission aggregometry，LTA)和电阻抗法(Multiple electrode aggregometry，MEA)。LTA法采用的是富含血小板血浆(PRP)，在富含血小板血浆中加入诱导剂诱导血小板生聚集，随着血小板聚集的发生血浆浊度逐渐降低，透光度逐渐增加，这种光浊度变化转换为电信号并记录下来，形成血小板聚集曲线[9]。通过血小板聚集曲线反映血小板聚集的程度和速度。电阻抗法采用的是全血样品，血小板经诱导剂作用发生聚集，浸泡在全血样品中电极探针间发生微小电流或电阻抗发生变化，从而反应血小板聚集功能[10-11]。光学比浊法是目前应用最广泛的血小板功能检测方法，是评估血小板功能的“金标准”。该方法是在低切变率的血浆环境中,血小板经诱导剂作用下而发生聚集，不能真实地反应血管壁损伤时血小板黏附、释放和聚集的功能[12]。电阻抗法是在全血的环境下，血小板并经诱导剂作用而发生聚集，更能真实地反映血小板在体内的活性和黏附功能。血小板聚集试验常用于监测的药物有阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂。该方法的优点是价格低廉，易于推广，与临床事件相关性好。缺点是试验所需的标本量较大，标本预处理程序比较复杂。

2.2 Verify Now POCT检测 Verify Now POCT检测是采用全血的床旁快速检测方法，其检测原理是使用血小板激活剂激活血液中的血小板，激活后的血小板与包被纤维蛋白原的珠子发生聚集反应，以此来检测血小板的活性，聚集的程度与血小板成功能呈正比。Verify Now POCT检测法可用于监测的药物有阿司匹林、P2Y12受体拮抗剂、GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂，其优点是采用全血作为标本，方法简单易行,检测结果重复好且与LTA法有较好的相关性[11]。缺点检测成本较高，普及难度较大。

2.3 流式血小板功能分析 流式血小板功能分析是通过流式细胞术检测血小板表面的活化标志物，判断血小板的活化状态，可以检测的血小板活化标志物有：P-选择素(CD62)、溶酶体颗粒膜糖蛋白(CD62)、血小板表面GPⅡb/Ⅲa受体等[9，11]。其中，P-选择素活化的血小板分子标志物，具有一定的特异性[11]。流式血小板功能分析的缺点是检测成本和技术要求较高,普及难度较大。

2.4 血管舒张刺激磷蛋白(Vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)检测 VASP是血小板细胞内的蛋白质，当ADP与P2Y12受体结合，激活P2Y12受体，使cAMP减少，VASP脱磷酸化，激活血小板聚集；相反，氯吡格雷阻断ADP与P2Y12受体结合，使cAMP增加，VASP磷酸化，抑制血小板聚集。目前VASP试验的常用检测方法有ELISA法和流式细胞技术。流式细胞技术通过测量单克隆抗体来定量磷酸化的VASP，其检测结果以血小板反应指数(Platelet reactivity index，PRI)表示。该试验能够高度特异性反映氯吡格雷和普拉格雷等P2Y12受体拮抗剂抑制血小板聚集效应，有效抑制时PRI值处于低水平；如抑制效果差，PRI则处于高水平[13-14]。流式细胞技术对检测时间的要求不高，要求检测48h内的血标本，检测结果与LTA法呈很好的相关性。VASP检测的优势在于P2Y12信号通路的特异性和检测结果的稳定性，该试验不足是检测过程相对复杂和成本较高[15]。

2.5 血栓弹力图 血栓弹力图(Thrombelastogram，TEG)是动态监测血液在体外凝固的全过程，从血凝块开始生成到纤维蛋白溶解，对凝血因子、纤维蛋白原、血小板聚集功能以及纤维蛋白溶解等方面进行凝血全貌的检测和评估。血栓弹力图分析仪主要由一次性反应杯、金属探针及其上的扭力丝组成，一旦血栓形成，反应杯中的金属探针受到样本中产生切变力的作用，左右旋转。通过金属探针和扭力丝将凝血过程中凝血块机械阻抗的变化记录到电脑上，并与时间相对应，绘制成图像，即为血栓弹力图[11，16]。通过加入不同的血小板诱导剂(花生四烯酸或ADP)，可以绘制出TEG血小板图，用于评估抗血小板药物疗效、指导个体化抗血小板治疗，预测患者的出血和血栓风险[17]。TEG检测方法的不足之处是价格昂贵，不能作为常规手段，往往作为LTA结果无法解释或无法获得时的替代手段[15]。

2.6 PFA-100、PFA-200血小板功能分析仪 PFA-100、PFA-200血小板功能分析仪是在体外运用血流动力学原理，模拟体内血管损伤时，高剪切应力下血小板的黏附与聚集能力[18]。检测试剂盒通常由毛细管、样本池和带有中央孔的生物活性膜组成。枸橼酸钠抗凝的全血注入试剂盒的贮存器中，在负压作用下，从储存器中的全血被抽吸，通过毛细管和和生物膜的中央孔，在高剪切应力下，使血小板充分暴露，黏附和聚集到胶原包被的生物活性膜上。随后，血小板接触到激动剂(如花生四烯酸或ADP)，高剪切力和激动剂共同作用，使血小板凝结成块，在孔膜中形成血小板血栓，最终堵塞了生物膜上的所有孔道。从全血被负压抽吸到生物活性膜的孔被凝块全部堵塞而血流停止的这段时间，被定义为封闭时间(CT)[19-20]。PFA-100血小板功能分析仪是模仿机体一期止血而设计的检测装置，对初期止血功能缺陷的血小板数量和功能异常、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)等有较高的检测价值[17，21]。PFA-200血小板功能分析仪是PFA-100的升级版，可以监测抗血小板药物的疗效。PFA-100和PFA-200血小板功能分析仪的优点是可以在床旁进行检测，操作简单、耗时短、检测样本量少，标本前期处理简单。缺点是缺乏公认的参考范围和疗效评估标准[22]，在临床应用中仍处于摸索阶段。

3 小结

大量循证医学证明，抗血小板治疗是预防和治疗血栓性疾病的最重要手段，然而在治疗过程中，不同的个体存差异，往往导致抗血小板治疗不足或过度的现象，引发血栓或出血的不良事件发生。因此，对血小板功能监测显得尤为必要。血小板功能的检测能够为临床个体化抗血小板治疗提供一定的数据支持，为预防出血和血栓等不良事件的发生提供一定的帮助。但是，由于血小板在体内参与凝血反应是一个复杂的过程，受多种物质、多种因素的影响，而且体外模拟试验与体内环境存在很大的差异，不能反映体内凝血过程的复杂情况。况且血小板功能检测方法多种多样，试验原理各不相同，检测结果的重复性和可比性差，而且缺乏公认的权威的抗血小板治疗诊断标准，临床医生在选择抗血小板治疗监测方法和疗效评估上存在着很大的困惑。相信随着血小板功能实验研究的深入和新技术的不断研发、临床资料与经验的不断积累，未来抗血小板药物的监测一定能够实现规范化和标准化,实现个体化抗血小板治疗，保证治疗的安全性和有效性。