抗氧化应激相关因子水平对老年脑外伤患者康复过程的影响

蒋华 胡显静 黄昌尧 王时强 李瑞

(黔西南州人民医院神经外科，贵州 兴义 562400)

脑外伤(TBI)是指由穿透、钝击、加/减速力导致的颅脑创伤，可严重影响患者的意识、神智、记忆或导致其他神经病学/神经心理学的异常，严重的脑外伤甚至可导致死亡，其致死率和致残率极高〔1〕。老年TBI患者的发病率逐年升高，合并患有多种基础疾病，预后效果差，采取针对性治疗措施具有重要意义〔2〕。

现有研究表明TBI的康复过程涉及人体内的氧化和抗氧化系统的相互作用〔3〕。TBI发生后，易出现脑组织缺血缺氧，产生大量活性氧(ROS)，当ROS产生量超过机体承受能力时机体可产生氧化应激，起到保护机体免受氧化损伤的作用〔4〕。人体内抗氧化应激相关因子有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽还原酶(GR)，小分子丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)等，这些抗氧化应激相关因子的含量或活性与TBI的康复有着密切的联系〔5〕。本研究通过揭示抗氧化应激相关因子与TBI等级之间的关系，为TBI临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1主要材料 Trizol试剂、TaqMan逆转录试剂盒(美国，Life Technologies公司)，qRT-PCR试剂盒(美国，GeneCopoeia公司)，BioRad IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统(美国，BioRad公司)，紫外可见分光光度计(美国，Thermo公司，Nanodrop 2000)，Multiskan MK 3酶标仪(美国，Thermo公司)，FS-1型电动匀浆器(江苏，新瑞仪器)，GSH、GSSG检测试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)，SOD邻苯三酚自氧化法活性检测试剂盒、CAT过硼酸钠作底物滴定法活性检测试剂盒、MDA硫代巴比妥酸法含量检测试剂盒(南京，建成生物工程研究所)。

1.2方法 于2010年1月至2015年1月选取经黔西南州人民医院确诊的15例老年创伤型脑损伤患者(TBI组)和15例老年健康志愿者(对照组)，分别检测血清样本中抗氧化应激相关酶SOD、CAT、GPX和GR的活性或表达，检测抗氧化应激相关小分子MDA、GSH和GSSG的含量。

另选取35例老年TBI患者，其中男29例，女6例，年龄60～78岁，平均(68.27±5.08)岁。另外选取性别及年龄分布与TBI患者一致的35例老年健康志愿者，参与SOD、CAT和MDA的测定，取平均值，以其平均值作为分界点，分别统计TBI患者在各伤残等级的人数分布，分析TBI等级(三级和四级，一级和二级)和SOD、CAT、MDA水平(≥健康志愿者平均值，<健康志愿者平均值)之间的相关性。研究方案经医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.3RNA提取和纯度、浓度测定 RNA提取：分别取TBI组及对照组的静脉血各约2 ml，4℃放置2 h，转速9 000 r/min离心10 min，收集上层血清。所取得的血清量200～500 μl，分别加入血清体积3倍量的TRIzol裂解液(假设所加裂解液的体积为V)，室温下静置5 min，加入1/3V氯仿，剧烈震荡15 s，静置5 min，4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上层液体到另一EP管中，加入2/3V异丙醇，混匀后，室温下静置10 min，离心、弃上清。加入75% 4/3V乙醇洗涤沉淀，4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥，加入30 μl无RNase双蒸水，充分溶解后，取1 μl测定RNA浓度和纯度，剩余RNA立即放入-80℃环境中，备用于qRT-PCR检测。将分装出的1 μl总RNA用于浓度测定。

浓度和纯度以紫外可见分光光度计(Thermo，Nanodrop2000)测定。先以1 μl的RNAase-free水作空白校对测定。测定波长260及280 nm的光密度(A)，计算其比值。当测定值小于3时方可正常进行RNA样本测定。RNA样本测定前给予速度离心，以使充分混匀，记录所测浓度值和A260/A280值。当A260/A280在1.8～2.0时表示RNA的纯度适中，所提取的RNA可用于后续实验，否则应予调整。

1.4qRT-PCR检测 测定方法：以1.3中提取的血清总RNA为模板，按TaqMan的逆转录试剂盒说明书进行操作，逆转录生成cDNA，以cDNA为模板，按GeneCopoeia公司的qRT-PCR试剂盒说明书进行操作，检测设备为BioRad IQTM5 Multicolor实时荧光定量系统(美国，BioRad)。

引物均由美国Invitrogen公司合成，其中CAT正义链：5'-GCCACAGGAAAGTACCCCTC-3'，反义链：5'-CGGTGAGTGTCAGGATAGGC-3'，扩增长度为281 bp。SOD正义链：5'-ACAAAGATGGTGTGGCCGAT-3'，反义链：5'-AACGACTTCCAGCGTTTCCT-3'，扩增长度为162 bp。GPX正义链：5'-AAGGCCGAGTATCCGATTT-3',反义链：5'-GCGAGCAGCTTCTTGAGG-3',扩增长度为308 bp。GR正义链：5'-TTACGCCAAGTTATTTAGGTGACA-3',反义链：5'-AAGAGTTACTCAAGAACAAGAA3-3'，扩增长度为236 bp。其中β-actin为内参，正义链：5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'，反义链：5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'，扩增长度为268 bp。2-ΔΔCt用于计算相对表达量。反应体系为20 μl，每组实验设置3个复孔。

1.5硫代巴比妥酸法测定MDA的含量 提取TBI组及对照组的静脉血血清，按照试剂盒说明书进行操作，用硫代巴比妥酸法测定所有样本的血清中MDA的含量以532 nm比色测定的OD值与四乙氧基丙烷标准曲线查出对应浓度，再乘以68.89即为血清中MDA的含量。

1.6过硼酸钠作底物滴定法测定CAT的活性 提取TBI组及对照组的静脉血血清，按照试剂盒说明书进行操作，用过硼酸钠作底物滴定法测定所有样本血清中CAT的活性。取干净的锥形瓶，按照说明书操作，每只中分别加入50 mmol/L的磷酸缓冲液和100 mmol/L的过硼酸钠，混匀，置于20°的水浴锅中加热10 min，加入待测的血清样品，达到所需的反应时间时，加入1 mol/L硫酸终止反应，用10 mmol/L的高锰酸钾液滴定测定CAT的活性。

1.7邻苯三酚自氧化法测定SOD的活性 提取TBI组及对照组的静脉血血清，按照说明书进行操作，样品孔和样品空白对照中分别加入血清样品，在不含抑制剂的空白对照和试剂空白对照中分别加入双蒸水。每孔均加入四氮唑(WST)工作液，混匀。样品空白对照和试剂空白对照中分别加入稀释缓冲液。样品孔和不含抑制剂的空白对照中分别加入酶工作液，混匀。37℃培养箱中培养20 min，用酶标仪在450 nm处读数。

1.85,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)速率比色法测定GSH和GSSG含量 试液配制：按说明书进行操作，分别配制GSH标准储存液(10 mmol/L)，50×GSH还原酶，GSH检测工作液，总谷胱甘肽(T-GSH)检测工作液，标准品和NADPH工作液。样本制备时尽量使用新鲜的血液进行测定，样本先4℃度放置2 h，转速9 000 r/min离心10 min，收集上层血清，加入蛋白沉淀工作液，充分振匀，4℃或冰浴放置，离心，取上清用于T-GSH含量测定。

测定操作：分别设置空白、标准和测定管，按说明书提供的顺序依次加入。按照动力学测定法，在酶标仪上的410 nm处每2 min检测一次吸光度值，采用空白管调零，总检测时长为6 min，检测其反应速率ΔA/min(浓度为横坐标，ΔA410/min为纵坐标，做标准曲线)。根据待测ΔA410/min和标准曲线计算GSH和T-GSH含量。其中GSSG含量=T-GSH含量-GSH含量。

1.9TBI患者的世界卫生组织残疾评定方案2.0(WHO-DAS Ⅱ)评定 WHO-DASⅡ是世界卫生组织制定的用于残疾等级评级的标准，使用WHO-DAS Ⅱ国际中文版检查者评定版问卷(http://www.who.int/classifications/icf/more_whodas/en/)，从理解交流、身体移动、生活自理、与人相处、生活活动、社会活动6个方面对TBI患者的整体功能进行综合评估，共36项评估指标。其中WHO-DAS Ⅱ总分值<52分为正常，即不存在障碍；52～95属于残疾四级，为适应行为轻度障碍；96～105分属于残疾三级，为适应行为中度障碍；106～115分属于残疾二级，为适应行为重度障碍；≥116分属于残疾一级，为适应行为极重度障碍〔6〕。按照各项指标的严重程度(无，轻度，中度，重度，极重度)统计各项人数。

1.10统计学处理 使用SPSS15.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1TBI组及对照组血清MDA含量及SOD、CAT、GSH和GSSG活性比较 和对照组相比，TBI组血清SOD、CAT和GSH活性显著降低，而MDA和GSSG的含量显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 TBI组及对照组血清MDA含量、SOD、CAT、GSH、GSSG活性比较

2.2TBI组及对照组血清SOD、CAT、GPX和GR mRNA表达比较 和对照组相比，TBI组血清SOD、CAT和GR mRNA表达水平显著降低，而GPX mRNA表达水平显著增加(P<0.05)，见表2。

表2 TBI组及对照组血清SOD、CAT、GPX和GR mRNA表达比较

2.3WHO-DASⅡ评定结果 在35例TBI患者中，WHO-DAS Ⅱ评分一级8例，二级10例，三级6例，Ⅲ级11例。

2.4TBI患者的残疾等级与MDA，SOD和CAT的关联性 35例老年健康志愿者MDA的含量为4.84 nmol/g，SOD的活性为62.31 U/mg，CAT的活性为12.07 U/mg。

35例老年TBI患者MDA，SOD和CAT资料按健康者的对应平均值分层后进行比较，结果显示：TBI患者的残疾严重程度愈高，其MDA的含量愈高，而SOD和CAT的活性则愈低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 TBI患者的残疾等级与MDA、SOD和CAT的关联性

3 讨 论

TBI是所有类型的创伤中危害最大的一种类型，其发生率高，致死率高，致残率也高〔7，8〕。通常TBI患者可经过抢救而幸存，但TBI常常会对患者产生较严重的生理和心理影响，例如在生理上，TBI可导致患者的运动障碍、神经传导障碍、感觉障碍、语言障碍、自主意识障碍等；在精神上，TBI可导致患者产生恐惧感或不安全感等〔9〕。随着我国人民生活水平高的日益提高，老年人的寿命逐渐增长，同时机体各项功能减退，老年人的脑部存在不同程度的萎缩，增加颅内缓冲空间，临床阳性症状不明显，容易造成漏诊〔10〕。近年来，多项研究报道指出氧化应激在TBI康复中发挥着极其重要的作用〔11～14〕。但人体本身的中枢神经系统具有耗氧量高和脂质含量丰富的特点，因此较容易发生脂质过氧化的现象，最终可导致对神经元的损伤，由于中枢神经系统对氧化损伤十分敏感，因此此时中枢神经系统会调用其本身的内源性抗氧化酶防御系统以维持细胞的氧化还原平衡〔15，16〕。人体内的氧化和抗氧化系统，相互依赖，相互制约，共同维持人体内环境的平衡〔17〕。

人体内的抗氧化系统主要有两大类。一类为抗氧化酶类，包括SOD、CAT、GR、GPX、谷胱甘肽转移酶、血红素氧合酶1等〔18,19〕。另一类为非酶性抗氧化剂，包括GSH、硫基蛋白、铜蓝蛋白、转铁蛋白、N-乙酰半胱氨酸、维生素C、脂溶性的抗氧化物质MDA、水溶性抗氧化物质等〔20,21〕。本研究结果表明脑损伤导致机体抗氧损伤相关的酶和产物SOD、CAT、GSH和GR的表达和活性均降低，而脂质氧化损伤后的产物MDA，GSSG和GPX表达均增加。本研究发现发现这35例老年患者均存在不同程度的障碍。且通过与老年健康志愿者的MDA，SOD和CAT含量/活性平均值比较，我们发现老年TBI患者的残疾严重程度愈高，其MDA的含量愈高，而SOD和CAT的活性则愈低,即老年TBI患者的残疾程度与MDA、SOD和CAT有关。后续研究拟收集老年TBI患者的临床病理学参数，分析MDA、SOD、CAT这三者与老年TBI患者生存、预后和其他病理学参数之间的相关性，进一步明确它们之间的关系，期望进一步探究TBI康复中的抗氧化应激机制，期望为TBI的临床药物开发提供的新的思路。