结膜成纤维细胞由来的警报素对角膜成纤维细胞的促炎作用

陈 琳，刘苹苹，杨秀霞，李 勤，刘 洋

(中山大学附属第五医院 眼科，广东 珠海519000)

眼部烧伤，是常见的严重眼部急症，占眼外伤的8-18%[1]。严重的眼烧伤，即使及时治疗，预后仍较差，常导致角膜上皮愈合不良，基质出现持续性角膜溃疡，角膜穿孔甚至失明[2]。持续的角膜基质炎症反应及炎性细胞的浸润，在严重角膜烧伤所导致的角膜基质溶解的发生发展过程中起着重要的作用[3]。损伤细胞在非感染性应激或损伤反应时会释放一类内源性的物质到细胞外环境中，可以与模式识别受体相结合启动机体的过度炎症反应，这一类内源性分子被称为损伤相关分子模式(DAMPs)也称为警报素(alarmins)[4]。Alarmins可以向周围的组织发送信号，将炎症细胞募集到受损的组织，并触发无菌性炎症反应[5]。为了改善眼烧伤的预后，目前国内外提出了各种内外科的治疗方法：类固醇、四环素或抗坏血酸；腱成形术；羊膜修补术等[6,7]。然而，这些疗法在治疗持续性角膜基质溶解方面的疗效仍不令人满意，寻找有效治疗角膜基质溶解的措施并阐明其机制是目前眼科学面临的重要课题之一。在本研究中，我们探讨结膜成纤维细胞坏死上清产生的警报素(alarmins)对人角膜基质成纤维细胞(HCFs)释放促炎因子及粘附分子的影响及可能机制，为眼部烧伤时抑制角膜基质炎症反应及溃疡形成的药物研发提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料人结膜成纤维细胞和人角膜基质细胞(HCFs)购于美国ScienCell；MEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素购于美国Sigma-Aldrich；PBS缓冲液购于广州晶欣公司；IκB-α、磷酸化-IκB-α购于美国Cell Signaling Technology；NF-κB 内源性抑制剂 (IκB 激酶 (IKK)-2 抑制剂)购于美国Merck Millipore；NF-κB p65购于美国Santa cruz；4′,6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)购于美国MP Biomedicals ；山羊抗鼠IgG(H+L)488荧光抗体购于美国Invitrogen；人IL-6 ELISA 试剂盒、人 IL-8 ELISA试剂盒、人 MCP-1 ELISA 试剂盒购于中国博士德公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 人结膜成纤维细胞和人角膜基质细胞成纤维细胞在10% FBS+双抗的MEM培养基及37℃，5% CO2培养箱中进行培养。使用胰蛋白酶EDTA处理分离细胞。第4-6代细胞用于随后的实验。

1.2.2结膜成纤维细胞坏死上清的制备 通过反复冻融处理获得人结膜成纤维细胞的坏死上清液[8]。将培养瓶中的人结膜成纤维细胞用PBS洗涤两次，然后用37℃的胰蛋白酶EDTA处理分离，并收集在10%FBS-MEM中。用无血清的MEM洗涤两次后，细胞以1×106cell/mL的浓度在无血清MEM中重悬。细胞在-196℃下的液氮中进行三轮快速冷冻3 min，然后在37℃水浴中再解冻3 min。细胞裂解物在15 000 rpm、4℃离心10 min后收集，获得坏死的人结膜成纤维细胞上清液(NHCS)。

1.2.3ELISA检测IL-6、IL-8、MCP-1分泌 按BOSTER ELISA试剂盒提供步骤进行实验，收集处理后的细胞上清液，并进行细胞计数。样品10倍稀释，每孔均加入100 μl稀释好的样品及标准品，37℃ 90 min，不洗。加入生物素标记抗体工作液，37℃ 60 min，洗3次。加入亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液，37℃ 30 min，洗5次。加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液， 37℃避光20 min。反应完成后，加TMB终止液，此时反应液呈黄色。用酶标仪测定OD值(450 nm)，读数。绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.2.4Western blot检测IκB、p-IκB、ICAM-1表达 收集处理后的细胞，每孔细胞培养皿加入100 μl裂解液(PMSF：RIPA的浓度比为1∶100)。BSA法进行蛋白浓度的测定。取10 μg样品上样，电泳90V，待条带进入分离胶时，改设置电压120 V，转膜恒流350 mA，90 min，常温封闭1 h，后根据目的蛋白加入相应的一抗滴度均为1∶1 000，4℃摇床过夜。二抗滴度均为1∶3 000，常温1 h。β-actin抗体用作内参用来判断各组间的上样量是否一致。

1.2.5免疫荧光染色检测NF-κB p65 将生长状态良好的HCF细胞接种于60 mm培养皿中，每皿放入3片细胞爬片。在无血清MEM培养基中孵育24 h后，加入3×105cell/mL NHCS或不加入NHCS，处理0 min或30 min后进行细胞免疫荧光染色。3%BSA封闭1 h后，加入一抗p65(滴度1∶50)常温2 h，荧光二抗(滴度1∶500)常温1 h，避光。DAPI染核，15 min，避光，后进行封片。

1.3 统计学分析数据采用SPSS19.0进行单因素方差分析，数值用均数±标准差P<0.05代表有统计学意义。

2 结果

2.1 NHCS对HCFs产生炎性介质的影响

无血清孵育后的HCFs在不同浓度的NHCS(0、0.1、0.3、1或3×105cell/mL)中处理相同时间(24 h)。免疫印迹检测显示，与未经NHCS处理组相比，NHCS明显促进HCFs分泌炎性因子IL-6(图1A)、趋化因子IL-8(图1B)、MCP-1(图1C)及表达粘附分子ICAM-1(图1G)，且呈浓度依赖性增加；同时，我们结果也发现，无血清孵育后的HCFs在相同浓度的NHCS(3×105cell/mL)作用不同时间(0 h、3 h、6 h、12 h、24 h)后， IL-6(图1D)、IL-8(图1E)、MCP-1(图1F)和ICAM-1(图1H)的表达也明显增加，呈时间依赖性。这些结果表明NHCS可诱导HCFs产生炎性因子IL-6、趋化因子IL-8、 MCP-1和粘附分子ICAM-1来介导HCFs炎症反应。

图1 NHCS对HCFs释放炎性因子、趋化因子及粘附分子的影响

2.2 NHCS对NF-κB信号转导的影响

NF-κB信号通路在眼部炎症中起着重要作用。为了研究NHCS对HCFs中NF-κB信号可能的影响，我们用3×105cell/mL NHCS对HCFs进行了不同时间的处理。免疫印迹分析表明， NHCS以一种时间依赖的方式激活参与NF-κB信号通路途径的IκB-α(图2A)。免疫荧光染色显示， NF-κB p65亚基(绿色荧光)在NHCS处理30 min后进入细胞核。(图2B)注：标尺为20 μM。以上结果表明，NHCS可通过诱导IκB-α磷酸化和介导NF-κB p65亚基入核参与NF-κB信号通路。

图2 NHCS对NF-κB信号转导的影响

2.3 IKK-2抑制剂对NHCS诱导HCFs产生炎性介质的影响

为了确定NF-kB信号通路在HCFs产生炎性介质过程中的作用，用不同浓度的NF-kB信号通路抑制剂IKK-2抑制剂(0、0.3、1、3、10 μM)孵育2 h，然后用3×105cell/mL NHCS+IKK2抑制剂孵育24 h。ELISA检测显示，添加IKK-2抑制剂的组能明显抑制NHCS所诱导的IL-6(图3A)、IL-8(图3B)和MCP-1(图3C)的表达，且呈浓度依赖性减少。同时，免疫印迹分析表明，用IKK-2抑制剂能够显著抑制NHCS诱导的粘附分子ICAM-1的表达(图3D)。以上表明，IKK-2抑制剂可抑制NHCS所诱导的HCFs炎症反应。

图3 IKK-2抑制剂对炎性介质表达的影响

2.4 IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)和TNF-α受体拮抗剂(R7050)对NHCS诱导HCFs产生炎性介质的影响

为了研究NHCS中的alarmins，我们首先将3×105cell/mL NHCS与IL-1RA(300 ng/mL)或R7050(1 000 ng/mL)处理2 h，然后再置于培养基中孵育HCFs,即孵育HCFs 24 h。ELISA检测显示，单独使用NHCS处理组与未使用对照相比IL-6、IL-8、MGP-1、ICAM-1表达明显增加，添加IL-1RA能明显抑制NHCS所诱导的IL-6(图4A)、IL-8(图4B)、MCP-1(图4C)、ICAM-1(图4G)的表达；同样，添加R7050能明显抑制NHCS所诱导的IL-6(图4D)、IL-8(图4E)、MGP-1(图4F)、ICAM-1(图4G)的表达。

3 讨论

在本实验中，我们发现NHCS通过激活NF-κB信号通路，并以浓度及时间依赖方式刺激HCFs表达ICAM-1、IL-6、IL-8和MCP-1。阻断NF-κB信号通路可以抑制上述炎性因子、趋化因子和粘附分子的产生。另外，我们的研究结果显示 IL-1或TNF-α受体拮抗剂可明显抑制HCFs表达上述炎性介质。

角膜发生炎症时，角膜基质细胞被激活成角膜成纤维细胞，通过调节炎性因子，如细胞因子、趋化因子和粘附分子等在局部免疫和炎症反应中发挥重要作用[9]。IL-6可以促进B细胞的增殖、分化及分泌，IL-8具有强趋化中性粒细胞到角膜组织的作用，并能使之激活，MCP-1则对单核细胞和嗜碱性粒细胞有趋化作用[9]。ICAM-1可通过调节细胞间粘附作用促进炎性细胞的局部浸润[10]。浸润的炎性细胞及活化的角膜基质细胞可分泌胶原酶，导致角膜基质胶原过度降解，形成角膜溃疡[11]。在碱烧伤的大鼠模型中，可以检测到IL-6、MCP-1和ICAM-1 mRNA的上调[12]。IL-6受体阻滞剂在角膜碱烧伤的抗炎作用中也起到了有效的作用[13]。我们的实验结果显示NHCS可以诱导HCFs产生粘附分子ICAM-1、炎症因子IL-6、趋化因子IL-8和MCP-1，表明NHCS可能通过诱导HCFs释放炎性介质促进角膜基质无菌性炎症反应的发生发展。

图4 IL-1RA和R7050对NHCS诱导HCFs产生炎性介质的影响

角膜溃疡的特征是角膜基质的过度降解。研究显示许多信号通路，如NF-κB介导的通路，参与角膜溃疡的发生[14]。NF-κB信号转导通路属于受蛋白水解酶调控的信号转导通路，核转录因子NF-κB在非活性状态下与其抑制蛋白(IκB)结合，IκB掩盖了NF-κB的核定位信号(NLS)，使NF-κB滞留在细胞质。上游的刺激信号使IκB在IKK(IκB kinase)的作用下发生磷酸化，继而被泛素酶体系识别降解， NF-κB从而被释放，暴露NLS，使NF-κB进入细胞核与靶基因结合，调节基因表达[15]。各种病理因素激活的NF-κB信号转导是由IκB的磷酸化和降解所触发的[16]。我们的实验结果显示，NHCS可促进IκB磷酸化，并介导p65亚基进入细胞核。此外，阻断NF-κB信号通路也可以抑制上述粘附分子ICAM-1、炎症因子IL-6、趋化因子IL-8和MCP-1的产生。这些结果表明，NF-κB信号通路参与了NHCS诱导的非特异性炎症反应。

损伤相关分子模式(DAMPs)即警报素(alarmins)是一类组织细胞损伤而产生的内源性模式分子，损伤细胞释放的alarmins主要包括高迁移率基团盒(HMGB)-1、S100蛋白、IL-1α、IL-33、热休克蛋白、钙网蛋白和纤维蛋白原降解产物[17]。这些分子可以触发非感染性炎症，促进伤口愈合和恢复组织稳态[18]。白细胞介素是一种重要的信使分子，具有调节细胞行为和启动炎症反应的能力[19]。IL-1细胞因子是一种典型的DAMP，介导多种炎症反应[20]。在非感染性骨关节炎中，IL-1α涉及软骨基质的破坏与修复，参与基质降解性蛋白的合成，IL-1β刺激骨关节滑膜成纤维细胞的增殖与粘附分子的表达，促进炎性细胞的浸润[21]。IL-1主要通过其受体发挥生物学效应[22]。其中IL-1激活NF-κB还需要IKK2的激活。TRAF6作为一个E3泛素连接酶，可将IRAK1和接头蛋白TAB2和TAB3连接到IL-1信号通路的中间分子上。IKK1、IKK2与调节亚基NEMO共同构成IKK核心复合体，其中NEMO结合到上游分子IRAK1和结合TAB2(TGF-β-activated protein kinase-binding protein 2)或TAB3的TAK1(TGF-β-activated protein kinase)的泛素链上，促使IκB发生泛素化降解，NF-κB被激活[23]。IL-1受体拮抗剂(IL-1RA)是一种通过与IL-1受体结合而减弱IL-1生物活性的抑制剂[17,24]。TNF-α是一种已知参与角膜炎症的炎症细胞因子，以三聚体的形式与细胞表面受体TNF-R结合发挥作用。在一项小鼠碱烧伤模型中进行的研究表明，TNF-α在24小时内明显上调，最终导致角膜穿孔和/或瘢痕形成[25]。在动物模型和临床研究中，抗TNF-α抗体已被证明对保护角膜不融化和促进伤口愈合有效[26]。我们实验结果表明， IL-1RA和R7050可抑制NHCS所诱导HCFs释放炎性介质，提示由结膜成纤维细胞坏死上清产生的警报素包括IL-1和TNF-α，通过促进HCFs表达各种炎性介质而介导角膜基质的无菌性炎症反应，从而进一步促进角膜基质溃疡的形成。

综上所述，坏死的结膜成纤维细胞释放的IL-1和TNF-α通过NF-κB信号通路可促进角膜基质成纤维细胞分泌炎性介质从而引起角膜炎症反应。IL-1和TNF-α可能成为治疗严重眼烧伤患者角膜基质降解的潜在治疗靶点，也为后期进一步进行的详尽机制研究奠定了理论基础。