血清PAI-1在非酒精性脂肪肝中的变化及临床意义

姜 潇,孙 梅

(大连市中心医院 消化内二科,辽宁 大连116033)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是西方国家最常见的慢性肝脏疾病，在我国的发病率也逐年递增。目前其发病机制尚不十分明确[1]。目前，肝活检仍然是唯一区分单纯脂肪变性与NASH、明确肝功能损伤及纤维化程度的方法，但由于其有创性、价格昂贵及潜在的并发症，临床应用受限[2]。因此，迫切需要开发可对NAFLD进行肝损伤程度的评估、明确NASH及显著纤维化的非侵入性生物标志物。

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是一种丰富的脂肪组织非特异性脂肪细胞因子，为丝氨酸蛋白酶抑制剂，在广泛的生理和病理过程，包括纤溶，凝血，炎症和伤口愈合中起关键作用[3]。近年来，科学家发现NAFLD患者外周血PAI-1水平较正常对照增高，来自动物研究的证据表明PAI-1在NAFLD发病中的潜在作用，减少PAI-1的产生可显著逆转肝脂肪变性和肝脏脂质积累[4]。因此，我们推测PAI-1外周血水平是否与NAFLD发生相关，且可否作为NAFLD可能的生物标志物。

1 材料与方法

1.1 临床资料

根据“非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018 更新版)”，纳入大连市中心医院2019年7月至2019年12月，临床诊断为NAFLD患者38例为实验组,而无其他肝病(病毒性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、血色素沉着症、威尔逊病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症，或药物性肝病)，并排除所有降脂、降糖、降压药物治疗的患者，同时选取性别和年龄匹配的正常对照者50例作为对照组。

1.2 ELISA法测定血浆中PAI-1水平

研究中使用的88份血样均被收集到含EDTA的试管中，在3 000×g离心15 min分离血细胞。将血浆收集到另一个试管中，并在-80℃下保存，直到实验使用。

检测了血浆中的PAI-1表达水平。商业ELISA试剂盒(Lifespan Biosciences Inc.,Seattle,W A,USA)用于检测血浆中PAI-1浓度(目录号LS-F12251)。所有步骤均按照制造商的说明进行：(1)标准，将空白和实验样品(用样品稀释液预处理)加入96孔微孔板中，用靶向特异性捕获抗体(抗PAI-1)预涂并在37℃下孵育1 h。(2)吸取各孔液体后，在微孔板中加入生物素结合检测二级抗体在37℃下孵育1 h。(3)再次抽吸液体，并用洗涤缓冲液清洗每口井3次。然后，将每口井中的液体取出，用冲洗缓冲液冲洗3次后，在37℃下将每口井注入HRP共轭物30 min。(4)同样，在至少冲洗5次后，在37℃下与四甲基联苯胺(TMB)底物孵育10-20 min。(5)最后，用50 μl的停止溶液终止显色反应，在450 nm波长下用微板阅读器立即测定各孔的光密度值。用标准曲线计算每孔PAI-1浓度(ng/mL)。

1.3 血浆胆汁酸测定

采集被观察对象晨间空腹静脉血3 ml，分离血浆，在3 000×g离心15 min分离血细胞并收集上层血浆。应用循环酶法测定血浆胆汁酸浓度(μmol/L)。

1.4 统计学方法

统计分析采用SPSS软件(SPSS Inc.,SPSS Standard version 18.0,Chicago,IL,USA)和GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.,GraphPad Prism version 5.01,La Jolla,CA,USA)进行。基于Kolmogorov-Smirnov检验，符合正态分布的数据表示为平均数±标准差。采用Studentt检验对连续变量进行分析，采用卡方检验或Fisher精确检验对分类变量进行分析，P值小于0.05代表具有统计学意义。采用单变量logistic回归模型评估各变量与NAFLD的关系。

每位受试者均获得书面知情同意。研究方案符合1975年赫尔辛基宣言的道德准则，并通过了大连市中心医院伦理委员会同意。

2 结果

2.1 基线特征及血浆PAI-1表达分析

本研究共纳入NAFLD患者38例(21名男性和17名女性)和对照组50例(30名男性和20名女性)的基线特征如表1所示。NAFLD患者与正常对照组相比，NAFLD组BMIs、收缩压和PAI-1水平较高，且具有统计学意义(P<0.001)，而年龄、胆汁酸及性别，两组比较无统计学意义(P>0.5)。

2.2 NAFLD相关因素的单因素和多因素分析

采用单因素logistic回归分析，发现许多因素与NAFLD的存在有关。然而，根据多元logistic回归分析，结果表明PAI-1与NAFLD的存在独立相关，OR 值为1.190，p值小于0.001。同时研究发现BMI与NAFLD发生独立相关，P值小于0.001。以上结果见表2。

表1 NAFLD患者与健康对照组基线特征及血浆PAI-1表达

表2 NAFLD发病相关因素的单因素和多因素分析

3 讨论

NAFLD是世界上成人和儿童最常见的慢性肝病，范围从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎、纤维化和肝硬化[5]。NAFLD与代谢综合征的特征密切相关，尤其是肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常，以及心血管疾病风险增加。

导致肝脏脂肪变性的确切代谢途径仍不清楚，NAFLD和心血管疾病之间的联系尚不十分清楚。在提出的机制中，纤溶系统与NAFLD、胰岛素抵抗和动脉粥样硬化有关联[6]。文献报道，PAI-1浓度升高导致血管系统血栓清除障碍并可能影响动脉粥样硬化病变的发展[7]。同时PAI-1是由肝细胞和脂肪细胞共同产生的纤溶途径中的一种急性期蛋白，在肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗中呈升高趋势。

最新的动物模型研究提示PAI-1和NAFLD的发病与肝脏脂质输出的抑制有关[8]。然而，其他研究表明，PAI-1升高与肝脏脂肪变性之间的联系可能是由肥胖和胰岛素抵抗介导的[9]。PAI-1在NAFLD发展中的作用仍需进一步研究，其亦可能成为NAFLD潜在的治疗靶点。

综上所述，PAI-1与NAFLD独立相关。PAI-1可能成为NAFLD诊断的重要生物标志物，仍需进一步研究证实。