自身免疫肝炎患者外周血PBMCs自噬基因表达及Th17/CD4+CD25+CD127lowTreg细胞与肝脏功能相关性研究

汪永强，李显勇，杨 琳，刘世军，项 明

(四川省内江市第二人民医院 检验科，四川 内江641001)

自身免疫性肝炎(AIH)是一种针对肝细胞自身免疫反应所介导的慢性肝损伤，目前对于AIH的发病机制尚未完全明确。研究报道该疾病与自身免疫异常、自身反应性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞缺陷、PD-L1等与AIH疾病的发生发展相关[1]。近年来研究证实自噬在自身免疫、炎症、神经退行性疾病等发病过程中扮演一定的角色[2,3]，自噬对B淋巴细胞、T淋巴细胞的存活进行调控，从而从多层次多方面参与了SLE的发生，Th17细胞过量分泌的IL-17细胞因子加重炎症细胞局部浸润及组织器官的损伤，且与肝损伤与炎症活动度相关[4,5]，表明自噬与自身免疫的核心淋巴细胞有一定的关系。但自噬与AIH的关系及Th17/Treg与肝脏功能相关性尚未见报道，本研究以AIH为研究对象，探讨AIH患者外周血PBMCs中自噬关键基因Beclin 1、LC3 mRNA表达及外周血Th17细胞、调节性CD4+CD25+CD127lowT(Treg)细胞含量，分析与肝脏功能相关性，探讨自噬与免疫平衡在AIH疾病发生中的作用。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1研究对象 以我院2015年7月至2019年6月收治的35例自身免疫性肝炎(AIH)为研究对象，该研究对象均为治疗前患者，男性16例，女性19例，平均年龄53±10.6岁，AIH诊断标准符合2008年国际免疫性肝炎小组提出的AIH诊断简化积分系统及2010版美国肝病学会发布的诊断指南，另选取30例我院健康管理中心体检者为对照组，无各类自身免疫性疾病、乙型肝炎、酒精性、药物性、代谢性肝病等，并经健康管理师评定为健康者，其中男14例，女16例，平均年龄(48±12.5)岁，以上两组在性别、年龄方面差异无统计学意义(P>0.05)。

1.1.2仪器与试剂 荧光定量PCR仪为ABI 7500，自噬基因Beclin 1与LC3基因表达引物合成与试剂为TaKara公司，荧光显微镜为奥林巴斯BX-51，间接荧光免疫试剂与免疫印迹试剂为德国(欧蒙)医学实验诊断有限公司。流式细胞仪为Beckman coulter公司，各类流式荧光标记单克隆抗体为Beckman公司，酶联免疫(ELISA)法检测白细胞介素IL-17试剂盒为武汉博士德公司，生化分析仪为Beckman AU5800，肝脏损害相关生化指标检测试剂为九强公司。

1.2 方法

1.2.1PBMCs提取 静脉采集研究对象2 ml静脉全血，EDTA-K2抗凝，与Hanks等体积混合并混匀，缓慢加入含Ficoll(4 ml)液的离心管中，2 000 r/min密度梯度离心25 min，用Tip头小心吸取中层细胞层，Hanks液离心洗涤3次，重悬待用。

1.2.2自噬相关基因Beclin 1与LC3 mRNA表达检测 两种基因引物序列参照文献设计并合成[6]，提取上述步骤所得PBMC细胞总RNA，经逆转录cDNA后用荧光染料法Sybr Green qPCR检测Beclin 1与LC3 mRNA的表达，扩增条件为95℃ 3 min，95℃ 7sec,57℃ 10sec,72℃15 sec,40cycle，AIH组与对照组与各组βactin内参比较，用2-△Ct方法计算基因相对表达水平并统计学分析。

1.2.3Th17细胞与Treg细胞的检测 操作流程严格按照Beckman coulter试剂盒说明书进行，用EDTA-K2抗凝全血，在试管中加入10 μl荧光抗体混合物和100 μl的抗凝全血，涡旋混匀后室温避光孵育20 min，加入500 μl Optilyse C红细胞裂解液，涡旋混匀后室温避光放置10 min，直至血液透亮，加入PBS，室温避光5 min，加入100 μl已充分混匀的Flow-count绝对计数微球，涡旋混匀后应用流式细胞仪，进行Th17、Treg细胞检测。IL-17水平检测，严格按照说明书用ELISA法检测血清中IL-17含量。

1.2.4抗核抗体与肝病相关自身抗体检测 间接免疫荧光法：用PBS缓冲液将血清1∶100稀释并点样，将Hep-2细胞/猴肝包被的基质玻片反扣加样板上(ASMA检测用大鼠胃基质)，按照说明书方法进行后续实验，在荧光显微镜BX-51下观察绿色荧光并摄像，进行定性与核型分析。免疫印迹法：步骤为：将待检血清用样本缓冲液1∶100稀释后加入包被有相应抗原的印迹膜条，室温摇床震动30 min，洗膜后加酶标记二抗，室温摇床震动30 min，洗膜后加显色剂显色10 min，用蒸馏水终止反应，用扫描仪扫描吸光度A值，观察结果。

1.2.5肝脏功能指标的检测 静脉血肝素抗凝，离心分离血浆，免疫球蛋白采用散射比浊法检测，各种酶类采用速率法检测，参数设置严格按照说明书进行。

2 结果

2.1 AIH组与对照组肝脏功能实验室指标与自身抗体结果

两组肝脏功能指标如表1所示，AIH组ALT、AST、TBIL、GGT、AKP、IgG均高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)。AIH组ANA阳性率(间接免疫荧光滴度大于1∶320或至少一项ANAs免疫印迹法检测阳性)为74.3%，高于对照组9.7%，χ2=27.86，P=0.000。AIH组自身免疫性肝病自身抗体阳性率(ASMA、M2、SLA/LP、LC-1、sp100、gp120至少一项阳性)为65.7%，对照组为3.2%，χ2=27.74，P=0.000。

表1 AIH 组与对照组血清肝脏功能指标水平比较

2.2 Beclin 1与LC3 mRNA表达相对量

目的基因与内参基因在两组实验溶解曲线分析呈现单一峰，扩增曲线光滑平稳。AIH组Beclin 1 基因相对表达含量为(5.73±4.07)×2-7,与对照组比较，差异无统计学意义(t=0.587,P=0.559)；AIH组LC3 mRNA基因表达相对含量为(2.82±2.06)×2-6，对照组为(6.45±5.04)×2-6，差异具有统计学意义(t=-3.745,P=0.001)，如图1。

图1 Beclin 1与LC3 mRNA表达

2.3 LC3 mRNA表达与肝脏功能指标的相关性

LC3 mRNA与ALTr=-0.360，P=0.034，与ASTr=-0.178，P=0.305，与GGTr=-0.074，P=0.672,与AKPr=-0.166，P=0.342,与TBILr=-0.097，P=0.580,IgGr=0.003，P=0.986,见图2。

图2 AIH组LC3 mRNA表达与肝功能指标相关性

2.4 Th17/CD4+T与Treg/C4+T、IL-17检测结果

AIH组Th17/CD4+T均值为2.61±2.09%，对照组为1.27±0.99%(t=3.394,P=0.001)，Treg/C4+T在AIH组为4.86±2.49%，低于对照组(8.32±2.26%)(t=-5.882,P=0.000)，AIH组血清IL-17结果为16.03±5.21 pg/ml，对照组12.86±4.19 pg/ml(t=2.704,P=0.009)，见图3至图5。

图3 AIH组Th17/CD4+流式图

图4 AIH组Treg/C4+T流式图

图5 Th17/CD4+T、Treg/C4+T、血清IL-17在两组中的含量

2.5 Th17/CD4+T与Treg/C4+T比值与肝脏功能指标的相关

Th17/Treg比值与ALT、GGT的相关性分别为r=0.596、0.506，P<0.05；与AST、AKP、TBIL、IgG的相关性分别为r=0.260、0.092、0.077、-0.061，P>0.05。如图6。

图6 AIH组Th17/Treg比值与肝功能指标的相关性

3 讨论

肝脏炎症、高免疫球蛋白血症、血清中可检测出多种自身抗体等是自身免疫性肝炎(AIH)的主要临床特征。目前的研究证实，该疾病与遗传因素、环境因素、药物或生物因素、自身免疫调节异常等相关[7,8]。随着医学技术水平的进步及对AIH认识的不断加深，我国AIH患者的检出率逐年增加[9]。

自身免疫性肝炎的诊断主要依据血清学和病理组织学检查，并排除其它病毒性肝炎。本研究纳入的35例研究对象均排除了各种类型肝炎及肝脏疾病。AIH的初期实验室检查主要体现在肝脏功能异常、高免疫球蛋白血症及外周血清检测到各种自身抗体,超过95%的自身免疫性肝炎患者出现血清学异常。Ⅰ型自身免疫性肝炎血清抗体主要为ANA和SMA抗体，Ⅱ型自身免疫性肝炎临床检出率很低，其自身抗体主要体现为抗LKM-1和LC-1[10,11]。本研究纳入的AIH患者肝脏酶学指标、总胆红素、免疫球蛋白IgG均较对照组高，与AIH的诊断相符合。AIH组ANA阳性率为74.3%，自身免疫性肝病自身抗体阳性率为65.7%，P=0.000。若以ANA和肝病相关自身抗体任一出现阳性计算，AIH自身抗体阳性率为91.4%(32/35)，与文献报道大致一致[12]，35例AIH患者中30例为I型自身免疫性肝炎，SMA检出14例，SLA/LP检出5例，sp100检出5例，gp210检出4例，表明自身抗体诊断AIH的特异性较差，但敏感性较高，本研究AIH患者自身抗体的类型主要体现在ANA和ANAs方面，我们在前期的研究也表明了这一点[13]。

自噬的通俗含义为“自食”，是由溶酶体介导降解和消化受损的细胞器、细胞成分、及生物大分子物质，达到细胞内稳态的主要机制，与细胞的增值、分化、凋亡等相关。自噬的生物学过程受细胞信号传导通路的控制，目前研究证实主要受一些列自噬相关基因(Autophagy-related genes,Atgs)及蛋白的精密调控[14]，Atgs种类较多，已证实的在自噬过程中起主要作用的有mTOR、Beclin 1、LC3等，其中mTOR信号通路为人类研究较多的自噬通路且活化后起负向调节自噬现象[15],在多种自身免疫性疾病领域表明，自噬与自身免疫性疾病的发生发生密切相关，自身免疫性疾病多肌炎方面，与坏死性肌病比较，多肌炎患者肌纤维自噬蛋白LC3和p62阳性率低于坏死性肌病，通过检测自噬蛋白可以很好地区分坏死性肌炎和多肌炎[16]。RA小鼠模型研究表明，青蒿酯下调小鼠软骨细胞中PI3K,AKT,mTOR,p-PI3K,p-AKT,p-mTOR Bcl-2 和 Bcl-x的表达，提高了Bax,LC3II/LC3I 、 Becline-1 蛋白的表达，同时青蒿酯通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通过加速软骨细胞自噬和凋亡，从反面证明RA小鼠模型软骨细胞自噬基因表达是下调的[17],也证实了mTOR信号通路为自噬通路且活化后起负向调节自噬现象。然而在活动性类风湿关节炎患者滑膜组织中，自噬相关基因Beclin、Atg5、LC3 mRNA和蛋白与关节置换术病人比较，均呈增高趋势，进一步研究发现，LC3-II蛋白与RA活动指标CRP、ESR、CCP具有较好的正相关性，表明RA患者滑膜中自噬机制是增强的[18]。这两个关于自噬与RA关系的研究结果并不一致，表明自噬与自身免疫性疾病之间的关系尚不清楚，是否与研究的细胞种类不同，尚需进一步研究。有关自身免疫性肝炎与自噬的研究报道更少，由于自身免疫性疾病的本质是机体产生自身抗体，故选取外周PBMC细胞更有说服力，我们的研究结果表明：AIH患者外周血PBMC细胞Beclin 1 基因表达与对照组没有差异，而LC3 mRNA基因表达明显下调，与采用相同研究方案的SLE患者结果比较一致[19]。进一步结果表明LC3 mRNA表达与肝脏谷丙转氨酶呈负相关。

机体免疫功能紊乱是发生自身免疫性疾病的因素之一，Th17细胞可促进自身免疫性疾病的发生，其主要机制是分泌的IL-17细胞因子诱导TNFα、IL-6等促炎分子及炎症细胞聚集与浸润，导致机体免疫炎症反应。相反CD4+CD25+Treg细胞通过表达CD25(IL-2a受体)、Foxp3、CTLA4以及趋化因子受体等，起到机体免疫平衡与自稳的作用，是机体重要的免疫调节细胞[20]。在AIH患者外周血PBMC细胞基因层面，证实白介素17A(IL-17A)、白介素22(IL-22)mRNA表达下调[21]。在AIH患者外周血清层面，IL-17、IL-6、 IL-21和 TNF-α 同样增高，流式细胞术也证实了Th17增高而Treg细胞降低，Th17频率与ALT、AST呈正相关，而Treg细胞没有相关性[22]。在动物小鼠模型和AIH急性期患者，CD3+CD4+CD25+Foxp3+Tregs细胞下降，CD3+CD4+CD25- Foxp3+T、 CD3+CD4+IFN-γ+Th1、 CD3+CD4+IL-17+Th17、 CD3+CD4+IL-2+Th22细胞以及 Th1/Th17/Th22-细胞因子均增高，IL-17A和IL-22 与肝脏损伤具有正相关性[23]。本研究同样证实AIH患者存在Th17与CD4+CD25+CD127lowTreg免疫失衡的现象，Th17频率与ALT、GGT呈正相关(P<0.05)，虽然与AST没有明显的相关性，但表明有一定的相关趋势。因Th17/Treg细胞是一对重要的促炎和抑制炎症的细胞，组合分析更能反映机体的免疫失衡状态，我们分析了Th17/Treg比值与肝功能指标的相关性，结果表明该比值与ALT、GGT具有正相关性，与TBIL、AST、AKP、IgG没有明显的相关性。

综上所述，AIH患者外周血免疫细胞存在自噬与免疫失衡现象，自噬与免疫失衡与肝脏损伤有关，提高机体自噬和免疫调节T淋巴细胞功能有望成为治疗AIH的新靶点。