S1P lyase在肝癌中的表达及对其预后的影响

邱志东，王雪红，孙维佳，金俊飞

(1.深圳市盐田区人民医院 普通外科，广东 深圳518081；2.桂林医学院附属医院 肝胆胰外科实验室，广西 桂林541001;3.中南大学湘雅医院，湖南 长沙410008)

原发性肝癌(PLC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中主要以肝细胞肝癌(HCC，简称肝癌)为主，这也是威胁我国公民健康的主要病理类型[1]。尽管近些年来肝癌的诊断和治疗水平不断提高，但是肝癌的总体治疗效果仍不尽如人意。因此寻找新的诊疗靶标具有重要的意义。

干预神经酰胺(Cer)信号通路、抑制细胞死亡是细胞逃逸凋亡、导致肿瘤发生的重要机制之一[2-4]。研究表明Cer的代谢通路与肝癌的发生有密切关系[5,6]。众所周知，Cer的代谢非常复杂[7]，在Cer代谢过程中，除Cer外，还产生很多与Cer相关的生物活性分子，比如神经鞘磷脂(SM)、神经鞘氨醇(SPH)以及1-磷酸神经鞘氨醇(S1P)等。Cer和Sph能够抑制细胞生长、促进细胞凋亡，S1P则刺激细胞生长、抑制细胞凋亡[8]。S1P lyase是 S1P裂解酶，其在调控S1P水平中起重要作用[7]。本研究旨在探讨S1P lyase在肝癌中的表达及其对肝癌预后的影响。

1 材料与方法

1.1 组织标本和临床资料

收集54例2015-2019年在桂林医学院附属医院行手术治疗的肝癌患者术后标本，所有病例的临床和病理诊断均为HCC，选取的癌旁组织与癌灶距离>1 cm，记录患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移、TNM 分期等临床数据。54例患者中男性患者45例，女性患者9例，年龄25-72岁，平均年龄(51.54±10.96)，病理分级1级10例、2级27例、3级8例、4级4例，出现转移40例，无转移14例，所有患者均在桂林医学院附属医院行手术治疗，术前均未进行放、化疗，无合并其它肿瘤，肿瘤分期依据采用国际抗癌联盟第8版TNM分期标准。所有样本都在样本离体后第一时间置于液氮，然后迅速置于-80℃冰箱冻存待用。所有肝癌样本的获取均取得患者本人及其家属的同意，并通过桂林医学院附属医院伦理委员会批准。

1.2 实验试剂

TRIzol 试剂购于Life Technologies (Gaithersburg,MD)，TB Green Premix 购于 TaKaRa(Tokyo,Japan)，FastQuant RT Kit (with gDNase) 购于天根 (中国北京)。

1.3 方法

1.3.1提取组织RNA及real-time PCR剪刀剪取50-100 mg的组织，在样品组织破碎仪下打碎组织。TRIZOl法提取组织中的总RNA，利用FastQuant RT kit (with gDNase)试剂盒合成cDNA。按照real-time PCR试剂盒的要求进行real-time PCR。每孔的反应体系如下：cDNA 2.0 μl,引物0.1 μM，TB Green Premix 12.5 μl，去酶水9.5 μl。基因表达量采用2(-△△CT) 的相对表达量法，GAPDH作为内参基因(表1)。

表1 引物序列

1.3.2Kaplan-Meier生存分析 根据Kaplan-Meier(www.kmplot.com)的分析结果，以无复发生存率(RFS)来评估S1P lyase在评价肝癌患者生存预后的价值。

1.3.3蛋白互作的网络构建 将S1P lyase导入到STRING(version 11.0)的数据库，得到一个蛋白质相互作用网络(PPI)。利用软件参数将神经鞘脂信号通路相关蛋白标出。

1.3.4统计学分析 利用SPSS 20.0软件对实验数据进行分析。以配对t检验、独立样本t检验及方差分析评价定量的实验数据，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 S1P lyase在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织

我们随机选取了54例肝细胞癌患者手术切除的癌及癌旁组织，采用real-time PCR 检测S1P lyase在肝癌及癌旁组织中的表达水平。结果显示(见图1)，S1P lyase在肝癌组织中的表达明显低于癌旁组织(P<0.05)。

T：肝癌组织，ANLT：癌旁组织，P**<0.05。

2.2 S1P lyase的表达与肝癌临床病理特征的关系

结合所选取病例的临床资料，我们进一步分析了S1P lyase的表达与肝癌患者的临床病理特征的相关性(表2、图2)。表2结果显示：S1P lyase mRNA表达水平与肿瘤大小及肿瘤分期相关，差异有统计学意义(P<0.05)，但是与患者年龄、性别、病理分级及转移无关；图2A结果显示，大于10 cm的肿瘤和小于10 cm的肿瘤相比，S1P lyase的表达明显降低(P**<0.05)，另外，图2B结果显示，在肝癌AJCC分期(第8版)为3期及4期的患者中，S1P lyase的表达明显比1期及2期的患者降低。

2.3 S1P lyase的低表达能够预测肝癌患者术后的远期生存率

我们通过Kaplan-Meier分析S1P lyase的表达与肝癌病人预后的相关性(图3)。结果显示，S1P lyase表达量越低，肝癌病人预后越差(HR=0.65,P=0.017)。

表2 S1P lyase表达水平与肝癌患者临床病理特征的关系

注：2个样本之间的比较运用t检验(t)，3个样本的比较运用方差分析(F)。统计学方法参考文献[9]。

2.4 潜在与S1P lyase存在相互作用的神经鞘脂信号通路蛋白

我们利用STRING数据库中预测了与S1P lyase相互作用的蛋白，发现位于网络节点位置的蛋白多与膜脂代谢、神经鞘脂代谢、神经酰胺代谢、膜脂合成、神经鞘脂合成通路相关。其中S1Plyase与神经鞘脂代谢通路有互作的蛋白有CERS2、CERS4、CERS5、CERS6、SGPP1、SGPP2、ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3。

3 讨论

在全世界的肿瘤中，肝癌发病率第5位，死亡率第4位[10]。2018年全球新增肝癌病人84.1万人，死于肝癌患者78.2万人[10]。而我国肝癌发病病例、死亡病例均占全球总病例数一半以上[11，12]。绝大多数肝癌患者确诊时已为中晚期，此类患者手术切除率低，复发率高，生存率低，因此针对中晚期肝癌进行深入研究，寻找除手术之外的治疗手段及诊疗靶点意义重大。

A：S1P lyase表达与肝癌肿瘤体积的关系，P**<0.05；B：S1P lyase表达与肝癌分期的关系，P***<0.01。

图3 S1P lyase的表达与肝癌病人预后的关系

S1P是神经鞘脂信号通路的重要生物分子，S1P主要通过其5种细胞表面受体(S1PR 1-5)发挥生物学效应[13],通过和相应的受体结合参与血管生成[14-16]及促进细胞的增殖和存活[17，18]。S1P由SK磷酸化SPH生成的,同时又可以被S1P lyase裂解成为乙醇胺和软脂醛。Uranbileg B等[19]的研究结果发现SK(由SPH合成S1P所需的酶)和S1P lyase(S1P裂解酶)表达均上调的情况下，S1P水平不是增高而是下降，说明S1P lyase是调控S1P水平的关键酶。我们的研究结果表明，S1P lyase在肝癌中的表达下降，说明在肝细胞的恶性转化过程中，S1P lyase可能出现了基因表达的缺失，S1P lyase可能是一种抑癌基因。

然而S1P lyase是在肝癌的早期还是晚期中发挥作用呢？我们进一步的研究发现，S1P lyase的表达与肝癌肿瘤的体积大小及分期相关，体积>10 cm的肿瘤中S1P lyase的表达更低，提示S1Plyase低表达可能促进肝癌细胞的增殖能力。作为调控S1P水平的关键酶，S1Plyase表达下降，会引起S1P水平的升高，而S1P水平增高可以促进肝癌细胞的增殖，因此推测S1P lyase可能通过调控S1P水平影响肝癌的增殖。众所周知，肿瘤的大小通常影响肝癌患者的预后，AJCC第8版肝癌分期更是把多发肿瘤直径>5 cm设为T3[20,21]，而巨大肝癌的患者常预示着肿瘤已进入晚期阶段，治疗效果较差，因此S1P lyase水平下降可能在晚期肝癌中发挥更重要的作用。我们的进一步研究结果表明，S1P lyase在AJCC分期3期及4期的患者中表达更低，说明S1P lyase可能在晚期肝癌中发挥作用，S1P lyase表达水平的下降可能在促进肝癌的发展中起重要作用。

与此同时，我们通过Kaplan-Meier分析S1P lyase的表达与肝癌病人预后的相关性。结果显示，S1P lyase表达量越低，肝癌病人预后越差。因此S1P lyase表达下降可以作为肝癌不良预后的一个重要指标。

然而，作为神经鞘脂信号通路的一个关键酶，S1P lyase发挥作用的方式可能不仅仅是直接裂解底物，进而影响S1P水平发挥作用。神经鞘脂信号通路的诸多蛋白可能存在相互作用，进而整体上影响某一种神经鞘脂分子的水平。我们利用STRING数据库中预测了与S1P lyase相互作用的蛋白，发现位于网络节点位置的蛋白多与膜脂代谢、神经鞘脂代谢、神经酰胺代谢、膜脂合成、神经鞘脂合成通路相关。其中与神经鞘脂代谢通路相关的蛋白有CERS2、CERS4、CERS5、CERS6、SGPP1、SGPP2、ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3。这些蛋白中CERS2、CERS4、CERS5、CERS6为Cer合成酶[22]，SGPP1、SGPP2可以将S1P去磷酸化生成SPH[23]，而ORMDL1、ORMDL2及ORMDL3则能负向调控神经鞘脂代谢通路[24]。

综上所述，S1P lyase在肝癌中低表达，而S1P lyase 低表达预示着肝癌患者的不良预后，因此S1P lyase可能是中晚期肝癌患者重要的治疗靶点。但是本研究仅是对S1P lyase的初步研究，还应从细胞功能实验及机制研究中进一步探讨S1P lyase在肝癌发展中作用及机制。