miR-223和miR-192在重症肺炎患儿血清中的表达意义

孙卉芳 孙永法 王丹凤

肺炎是儿童时期尤其是婴幼儿时期最为常见的呼吸道感染性疾病。临床根据病情严重程度，将肺炎分为轻症肺炎和重症肺炎，前者症状轻、无并发症、预后好；后者起病急、变化快、病情重、并发症多，常可危及儿童生命，是导致5岁以下儿童死亡的主要原因[1-2]。在肺炎患儿中，有8%～14%属于重症肺炎。儿童重症肺炎具有发病快、并发症多，常累及全身、典型表现常被掩盖或被忽略等特点，如果抢救时间仓促极易导致诊治不当，会使病情进展恶化，甚至死亡。因此，对儿童重症肺炎的诊断和正确治疗是儿科的重大课题[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类小分子非编码的基因表达调控因子，介导转录后的基因沉默，它是一类高度保守、长度很短的内源性非编码单链RNA，约20～24 nt。他们参与了许多生物过程，包括新陈代谢、细胞周期、细胞凋亡和疾病控制，在心血管、呼吸、神经和造血系统等多个系统内都发挥作用，还报道了miRNA 参与红细胞生成和血管生成。大量研究表明miRNA 与肺的生长发育、肺炎、肺癌以及肺纤维化等肺部疾病的发生发展及转归有着密切的联系[5-6]。本实验旨在研究miR-223 与miR-192在重症肺炎患儿中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2019年1月本院收治的120例肺炎患儿为研究组，男性66例，女性54例，平均（3.56±1.20）岁。同时选取同期健康体检儿童120例为对照组，其中男性60例，女性60例，平均（3.85±1.33）岁。根据重症肺炎诊断标准将研究组患儿分为轻度感染组、中度感染组与重度感染组，各40例[7]。本研究经本院伦理委员会批准，所有患儿家属知情且签署同意书。经影像学检查显示患儿具有片状浸润阴影、间质性肺炎等炎性改变，自身有一定的免疫性疾病。排除标准：既往窒息病史者；先天性心脏病、支气管发育不良等先天性疾病者；合并吸入性肺炎、败血症等感染性疾病者；意识障碍等；家族性疾病患儿。对照组与研究组患儿性别、年龄等资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

抽取各组患儿清晨空腹静脉血5 mL，4℃条件下经3 000 r/min 离心15 min，吸取上清至EP 管内，置于-80℃超低温冰箱保存。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-223、miR-192 的表达水平

采用Trizol（美国Invitrogen公司）法血清中的总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA 浓度。根据反转录试剂盒（美国Thermo Fisher公司）说明书操作将总RNA 反转录合成cDNA。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA 为模板进行qRT-PCR反应，反应体系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 补足体系至20 μL；反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。miR-223、miR-192 以U6 为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.2.3 检测血清ApoE、CRP、PCT水平

采用免疫比浊法检测血清载脂蛋白E（ApoE，apolipoproteinE）与C-反应蛋白（CRP，C-reactive protein）的水平，检测仪器日立HITACHI7180 与配套试剂购自东莞市毅万光源有限公司；采用化学发光法检测血清降钙素原（PCT，procalcitonin）的水平，mini-VIDAS 免疫分析仪及其配套试剂购自法国生物梅里埃股份有限公司。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以（）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用n（%）表示，行χ2检验；采用Pearson 法分析重症肺炎患儿血清miR-223、miR-192 相关性及其两者表达与ApoE、CRP、PCT水平的相关性；受试者工作特征（ROC，receiver operating characteristic）曲线分析血清miR-223、miR-192 对重症肺炎的诊断价值。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-223 与miR-192 的表达水平和ApoE、CRP、PCT水平比较

与对照组相比，研究组血清miR-223 的表达水平显著升高，血清miR-192 的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，研究组血清ApoE、CRP、PCT水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组血清miR-223、miR-192 的表达水平和ApoE、CRP、PCT水平比较（±ss）Table2 Comparison of the expression levels of serum miR-223 and miR-192 and the levels of ApoE，CRP and PCT between the 2 groups（±s）

表2 两组血清miR-223、miR-192 的表达水平和ApoE、CRP、PCT水平比较（±ss）Table2 Comparison of the expression levels of serum miR-223 and miR-192 and the levels of ApoE，CRP and PCT between the 2 groups（±s）

组别对照组研究组t值P值n 120 120 miR-223 1.68±0.30 2.27±0.38 27.391 0.000 miR-192 0.90±0.25 0.45±0.30 20.651 0.000 ApoE（mg/dL）2.33±0.47 5.98±0.96 13.951 0.000 CRP（mg/L）5.21±1.89 10.35±2.67 13.695 0.000 PCT（ng/mL）0.15±0.03 0.37±0.10 15.632 0.000

2.2 不同感染程度患儿血清miR-223 与miR-192的表达水平比较

与轻度感染组相比，中度感染组与重度感染组血清miR-223 的表达水平显著升高（P＜0.05），血清miR-192 的表达水平显著降低（P＜0.05），见表3。

2.3 重症肺炎患儿血清miR-223与miR-192相关性

Pearson 相关性分析结果显示，重症肺炎患儿血清中miR-223 与miR-192表达呈负相关（r=-0.226，P＜0.001）。见图1。

2.4 重症肺炎患儿血清miR-223 与miR-192 与ApoE、CRP、PCT 的相关性分析

采用Pearson 法结果显示miR-223 与ApoE、CRP、PCT 呈正相关（P＜0.05），miR-192 与ApoE、CRP、PCT 呈负相关（P＜0.05），见表4。

表3 不同感染程度血清miR-223 与miR-192 的表达水平比较（±s）Table3 Expression levels of serum miR-223 and miR-192 at different infection levels（±s）

表3 不同感染程度血清miR-223 与miR-192 的表达水平比较（±s）Table3 Expression levels of serum miR-223 and miR-192 at different infection levels（±s）

注：与轻度感染组相比，aP＜0.05。

组别轻度感染组中度感染组重度感染组F值P值n 40 40 40 miR-223 1.91±0.32 3.21±0.56a 3.69±0.45a 25.669 0.000 miR-192 0.85±0.29 0.45±0.21a 0.40±0.25a 30.587 0.000

表4 肺炎患儿血清miR-223、miR-192 与ApoE、CRP、PCT的相关性分析Table4 Correlation analysis of serum miR-223，miR-192 and ApoE，CRP，PCT in children with pneumonia

2.5 血清miR-223 与miR-192 对重症肺炎的诊断价值

ROC 分析血清miR-223、miR-192 以及两个基因联合对重症肺炎的诊断价值。miR-223、miR-192 诊断重症肺炎时的敏感度、特异度、AUC 面积、Z值，尤登指数、标准误值等，见表5。

表5 血清miR-223与miR-192对重症肺炎的诊断价值Table5 Diagnostic value of serum miR-223 and miR-192 in severe pneumonia

3 讨论

重症肺炎是一种呼吸系统急危重疾病，发展迅速、病情凶险，应快速采取针对性措施进行综合治疗以改善患儿预后。重症肺炎表现为肺部症状呼吸衰竭，还有全身中毒症状，其他脏器功能不全甚至衰竭，即常见的脓毒血症。脓毒症的感染灶分布于全身各处，临床常见于肺部、腹膜、胆道系统、泌尿生殖系及脑膜炎等，皮肤脓肿也可引起脓毒症，常常表现为全身炎症反应综合征。重症肺炎可导致脓毒症的发生，而脓毒症也最常累及肺部，是引起呼吸衰竭最常见的原因，两者互相影响。脓毒症也是重症肺炎患儿的主要死亡原因之一[8-9]。医院获得性肺炎是重症患儿高死亡率的重要原因之一，其死亡率大约在33%～50%[10]，其主要病原菌是铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌，如若推迟抗感染治疗时间，死亡率将增加至60%[11-12]。

miRNA 在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA 作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的技术miRNA 芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。颜保松等[13]研究表明，miR-223 可作为肺结核潜在的有诊断价值的标记物。柳新胜等[14]研究表明，miR-192 可以评估相关性肺炎患儿病情严重程度。

综上所述，重症肺炎患儿血清miR-223表达水平升高，miR-192的表达水平降低，且与肺炎严重程度有关，并可能作为早期诊断重症肺炎的分子标志物，临床中对重症肺炎患儿应给予早期有效诊断，并进行适当的治疗，可有效提高临床疗效。