益赛普联合柳氮磺吡啶治疗强直性脊柱炎疗效及miR-29a、miR-146a的变化

张诺 郭明蔚 陈桂武 李刚

强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）属一种以脊柱慢性炎症为主要特征的慢性风湿性疾病，药物治疗为AS 主要治疗手段，治疗关键在于减轻炎症，缓解临床症状，避免畸形，维持正常姿势与最佳功能位置[1]。柳氮磺吡啶属治疗AS 传统药物，虽具有一定疗效，但作用有限，且副作用较大[2]。益赛普属肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）拮抗类药物，能抑制TNF-α 表达，阻断其引起的炎症反应，减轻患者病情[3]。此外，近期研究发现，miR-29a、miR-146a 等miRNAs 于自身免疫功能及多种炎症调节过程中具有重要作用，可参与风湿性疾病发生、进展[4-5]。但关于益赛普联合柳氮磺吡啶治疗对AS 患者疾病治疗效果及外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中miR-29a、miR-146a 表达影响如何尚不明确，本研究通过前瞻性研究对其进行分析。如下报道。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取本院2016年8月至2019年8月AS 患者123例进行前瞻性随机对照研究，以随机数字表将患者分为对照A组（n=41）、对照B组（n=41）、观察组（n=41）。本研究经医院伦理委员会批准。

纳入标准：①符合《强直性脊柱炎的诊断与治疗骨科专家共识》中AS 临床诊断标准[6]；②初诊患者；③入组前2个月未应用改善病情药物；④疾病处在活动期；⑤患者知晓本研究，自愿签订知情同意书。排除标准：①合并心、肾、肝等脏器功能严重障碍；②合并脑血管疾病、血液系统疾病、恶性肿瘤；③伴有结核感染；④合并精神、认知功能障碍；⑤依从性差，无法配合完成治疗；⑥对研究应用药物过敏。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法

①对照A组给予益赛普（三生国健药业（上海）股份有限公司，国药准字S20050059）治疗：25 mg 益赛普加入1 mL 生理盐水，在三角肌下缘采取皮下注射，起始剂量2次/周，待患者病情缓解后逐渐降低应用剂量，9～12周减量到25 mg/周，若出现减量后病情反复，可回调剂量。②对照B组给予柳氮磺吡啶（上海信谊天平药业有限公司，国药准字H31020557）治疗：1.0 g/次，2次/d，口服。③观察组给予益赛普联合柳氮磺吡啶：益赛普应用剂量与方法同对照A组，柳氮磺吡啶应用剂量与方法同对照B组。3组均治疗12周。

1.3.2 检测方法

①血清炎症因子检测：采集患者清晨空腹静脉血样5 mL，取3 mL 血样以离心机离心10 min（转速：2 500 r/min 离心半径：10 cm），提取血清，低温冻存待检；以免疫比浊法测定血清C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平，双抗夹心酶联免疫吸附法测定血清TNF-α、基质金属蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase-3，MMP-3）水平，检测试剂盒均购于武汉默沙克生物科技有限公司，有关操作严格按试剂盒说明书执行。②PBMCs 中miR-29a、miR-146a 检测：取2mL 血样以Ficoll 分离液分离出PBMCs，按Trizol试剂盒说明书提取PBMCs 中Small RNA，放置到无RNA 酶水内保存；设计及合成引物，引物合成与测序均由生工生物工程上海（股份）有限公司完成；合成cDNA，应用美国ABI公司提供的7300 荧光定量PCR 仪以实时荧光定量PCR 法测定PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平，每个标本测定3个复孔，以2-△Ct计算血清miR-29a、miR-146a 相对表达量。

1.4 疗效评价

治疗12周依据国际AS 评价工作组（Assessment of Spondyloarthritis International So-ciety，ASAS）标准[7]评价疗效，以达到AS 疗效评价标准20%改善（ASAS20）归为改善，未达到为无效，ASAS20 定义：与治疗前相比，总体评价（Patient global assessment，PGA）、脊柱炎症、夜间痛与脊柱痛视觉模拟评分量表（Visual analogue scale，VAS）分值、Bath 强直性脊柱炎功能指数（Bath ankylosing spondylitis functional index，BASFI）4项指标中≥3项改善在20%及以上，且VAS 分值降低≥1分。改善率=改善例数/总例数×100%。

1.5 观察指标

3组治疗12周后疗效。3组治疗前、治疗4、8、12周后症状与病情改善情况[脊柱痛、晨僵时间、AS活动指数（BASDAI）评分]，脊柱痛应用VAS 量表评价，总分10分，分值越高疼痛程度越高，AS 活动指数包括关节疲倦、肿胀、疼痛程度等维度，总分10分，分值越高病情越严重[8]。3组治疗前、治疗4、8、12周后血清炎症因子指标（CRP、TNF-α、MMP-3）水平。④3组治疗前、治疗4、8、12周后PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析数据，计量资料以（）表示，t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料用n（%）表示，行χ2检验；等级资料应用Ridit 分析，Z检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组基本资料的比较

3组年龄、体质量、病程、性别、吸烟与饮酒人数比例、病变部位、CT 分期等一般资料相比，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 3组一般资料比较[n（%），（±s）]Table1 Comparison of three groups of general data[n（%），（±s）]

表1 3组一般资料比较[n（%），（±s）]Table1 Comparison of three groups of general data[n（%），（±s）]

资料年龄（岁）体质量（kg）病程（年）性别（男/女，例）吸烟饮酒病变部位 双侧单侧CT 分期 Ⅳ期Ⅲ期Ⅱ期观察组（n=41）30.82±4.13 61.94±6.42 2.85±0.64 25/16 8（19.51）13（31.71）14（34.15）27（65.85）4（9.76）20（48.78）17（41.46）对照A组（n=41）31.42±4.56 62.76±7.14 3.02±0.49 23/18 9（21.95）11（26.83）13（31.71）28（68.29）5（12.20）21（51.22）15（36.59）对照B组（n=41）30.49±5.07 62.27±6.56 2.93±0.56 24/17 11（26.83）13（31.71）16（39.02）25（60.98）3（7.32）24（58.54）14（34.15）F/Z/χ2值0.430 0.155 0.624 0.201 0.647 0.309 0.501 0.253 P值0.651 0.857 0.400 0.904 0.724 0.857 0.779 0.969

2.2 临床疗效

41例治疗12周后临床疗效改善率比较结果显示，观察组最高39（95.12%），其次是对照A组32（78.05%），最低是对照B组25（60.98%），而无效率则是对照B组最高16（39.02%），其次是对照A组9（21.95%），最低是观察组2（4.88%），差异有统计学意义（χ2=13.95，P＜0.05）。

2.3 症状与病情改善情况、炎症因子、miR-29a、miR-146a 水平

3组治疗前脊柱痛、晨僵时间、BASDAI 评分、血清CRP、TNF-α、MMP-3及PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗4周、8周、12周后脊柱痛、晨僵时间、BASDAI评分、血清CRP、TNF-α、MMP-3及PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平比较结果为：观察组＜对照A组＜对照B组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

AS 可造成反复腰背疼痛、四肢关节肿痛，病情严重者甚至会出现受累关节功能丧失、脊柱畸形等，累及全身多种系统。柳氮磺吡啶可于肠道中降解成5-氨基水杨酸，发挥抗炎、免疫抑制效果，缓解因各类炎症造成的临床症状，减轻病情[9]。但单纯应用柳氮磺吡啶治疗对部分患者疗效不佳。

表3 3组症状与病情改善情况、炎症因子、miR-29a、miR-146a 水平比较（±s）Table3 Comparison of symptoms and improvement of condition，inflammatory factors，miR-29a，miR-146a levels in 3 groups（±s）

表3 3组症状与病情改善情况、炎症因子、miR-29a、miR-146a 水平比较（±s）Table3 Comparison of symptoms and improvement of condition，inflammatory factors，miR-29a，miR-146a levels in 3 groups（±s）

时间治疗前治疗4周后治疗8周后治疗12周后组别观察组对照A组对照B组F值P值观察组对照A组对照B组F值P值观察组对照A组对照B组F值P值观察组对照A组对照B组F值P值n 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41 41症状与病情改善情况脊柱痛（分）6.03±1.24 5.97±1.31 5.92±1.16 0.081 0.922 3.04±1.01 4.22±1.10 5.17±1.24 37.172＜0.001 2.63±0.41 3.08±0.45 3.61±0.53 45.430＜0.001 1.84±0.32 2.97±0.36 3.38±0.41 195.552＜0.001晨僵时间（min）48.23±14.57 47.64±16.03 47.17±15.22 0.050 0.952 21.34±5.63 28.79±7.02 40.06±10.21 58.987＜0.001 16.57±4.45 22.18±6.09 29.10±7.23 44.386＜0.001 12.48±3.11 17.15±4.06 23.60±4.79 78.103＜0.001 BASDAI评分（分）6.05±1.34 6.11±1.28 5.98±1.41 0.096 0.909 3.56±0.81 4.33±0.86 5.02±0.93 29.024＜0.001 3.07±0.42 3.74±0.50 4.39±0.67 61.217＜0.001 2.37±0.35 2.88±0.41 3.42±0.44 70.035＜0.001炎症因子CRP（mg/L）31.55±6.28 30.46±5.71 30.72±6.03 0.368 0.693 20.12±4.07 24.33±4.25 28.14±4.81 34.269＜0.001 15.13±3.49 19.34±3.61 23.39±4.12 49.738＜0.001 12.31±3.16 15.42±3.50 19.93±4.08 46.437＜0.001 TNF-α（μg/mL）411.38±54.26 412.53±57.29 410.77±56.07 0.011 0.990 354.20±27.10 382.26±30.02 405.31±31.17 30.908＜0.001 334.52±24.06 362.29±25.11 387.30±28.19 42.783＜0.001 315.04±30.44 334.27±32.38 368.19±40.14 24.839＜0.001 MMP-3（pg/mL）110.58±12.15 112.06±14.03 111.62±11.88 0.146 0.864 91.26±8.02 98.17±8.43 106.69±10.14 30.846＜0.001 85.33±6.61 92.20±8.34 101.38±9.57 38.939＜0.001 78.30±9.17 85.19±10.22 96.21±11.36 31.609＜0.001 miR-29a 0.80±0.20 0.78±0.17 0.81±0.22 0.245 0.783 0.56±0.10 0.68±0.11 0.76±0.13 31.959＜0.001 0.43±0.11 0.54±0.12 0.67±0.13 40.906＜0.001 0.30±0.10 0.42±0.12 0.61±0.17 56.385＜0.001 miR-146a 2.21±0.34 2.23±0.31 2.18±0.28 0.269 0.765 1.51±0.17 1.87±0.20 2.06±0.22 81.825＜0.001 1.02±0.24 1.40±0.31 1.85±0.36 74.952＜0.001 0.78±0.23 1.02±0.25 1.44±0.30 66.830＜0.001

临床研究指出，TNF-α 于免疫调节、炎症反应等方面起着重要作用，可刺激滑膜与软骨成纤维细胞生成前列腺素E、胶原酶等，加速骨吸收及骨质破坏，阻止骨胶原生成，引起局部炎症，参与AS发病与病程进展过程[10]。可见抗TNF-α 生成为治疗AS 重要靶点。益赛普属典型TNF-α 拮抗剂，田军伟等[11]研究报道，应用益赛普治疗AS 患者可显著改善患者临床症状与关节功能，提升疗效。本研究发现，应用益赛普联合柳氮磺吡啶治疗后患者临床症状与病情改善，疗效提升，与上述研究相符。推究其原因为益赛普主要由TNF-α 受体p75 胞外段和人IgG1 Fc 段相融合而形成，能不可逆地竞争性结合血浆与细胞表面TNF-α，抑制TNF-α 生物学活性，减轻机体炎症，缓解AS 病情[12]。将益赛普、柳氮磺吡啶结合应用可由不同途径减轻机体炎症，缓解病情，进而增强治疗效果。同时，CRP 属促炎性细胞因子，可参与免疫调节，诱导炎症反应，与TNF-α 一同参与AS 炎症反应发生、进展过程；MMP-3 为MMPs家族中一员，可起到降解细胞外基质与基质重塑作用，且与骨破坏、关节软骨病、炎性关节疾病等有关，表达与TNF-α、CRP 水平呈正相关，属判定AS 病情的重要指标物[13]。本研究中，应用益赛普联合柳氮磺吡啶治疗后血清CRP、TNF-α、MMP-3 水平显著改善，亦证实联合治疗可减轻机体炎症反应，抑制病情进展。

近期研究报道，miR-29a 可直接靶向调控Dickkopf-1 的3′UTR 区域，加速Wnt/β-catenin 信号通路激活，提高成骨细胞碱性磷酸酶、骨钙素等有关因子表达；miR-146a 能阻止白细胞介素-1 受体有关激酶1 与TNF 受体有关因子6 表达，加速破骨细胞生成，促进骨质破坏，2者表达与AS 疾病活动性密切相关[14-15]。本研究中，应用益赛普联合柳氮磺吡啶治疗后PBMCs 中miR-29a、miR-146a 水平明显降低。原因可能与应用益赛普联合柳氮磺吡啶治疗后机体炎症减轻，骨质破坏减弱，病情缓解等有关，但具体机制仍有待将来进一步探讨。

综上，联合应用益赛普与柳氮磺吡啶治疗AS 患者能缓解机体炎症反应，下调PBMCs 中miR-29a、miR-146a表达，减轻临床症状、病情，提高疗效。