HAART 治疗SIVmac239 感染恒河猴血浆细胞因子与疾病指征的相关性分析

田 龙,童 玲,丛 喆,陈 霆,薛 婧,魏 强

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,卫健委人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室,北京 100021)

通过HAART 治疗临床上已经达到对HIV-1 感染的有效控制,但同时临床也发现在血浆病毒载量得到有效控制的同时艾滋病感染者体内多种细胞因子的浓度仍然处于高水平状态。 这些升高的细胞因子不仅会影响疾病的进展和治疗效果,还能导致非HIV 定义性疾病(Non-AIDS-defining diseases,NAD),如心脑血管疾病、慢性肝肾与骨骼疾病以及非艾滋病定义性肿瘤[1-5]。 此外,在进行HAART 治疗中依然存在不少血浆病毒载量控制效果不佳的案例[6],并且在治疗失败的案例中也观察到了细胞因子浓度异常的现象。 针对以上问题,本研究对HAART 治疗的SIVmac239 感染恒河猴血浆细胞因子在感染、治疗和停药状态下的浓度及其与疾病指征的相关性进行了研究,以期为临床改进治疗方案降低艾滋病免疫激活的不利影响提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

3 只SPF 级,3 ～4 岁,4 ～5 kg,雄性中国恒河猴购自北京协尔鑫生物资源研究所[SCXK(京)2015-0011],实验动物的饲养及操作在生物安全三级实验室内完成[SYXK(京)2017-0027]。 实验动物使用和管理委员会批准号为(XJ19005)。 遵循3R 原则对动物进行关怀。 实验前进行血清学检测,检测结果显示实验猴未受到猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录D 型病毒(SRV-1)、猴T 淋巴细胞性I 型病毒(STLV-1)和猴B 病毒(BV)等可能对实验造成显著影响的病原体的感染。

1.2 主要试剂

流式抗体PerCP Mouse Anti-Human CD3 (货号:552851),PE Mouse Anti-Human CD8 (货号:555367) 购 自 BD 公 司； FITC anti-human CD4 Antibody (货号:317408) 购自Biolegend 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit (货号: 52906) 购自QIAGEN 公司；TaqManTMRNA-to- CTTM1-Step Kit(货号:4392938) 购自Thermo Fisher 公司；多因子检测试剂盒Custom Premix Non-Hu Primate Cyto MAG09 (货号:PRCYTOMAG- 40 K-09C)、TGF-β1检测试剂盒MILLIPLEX MAP TGFß1 Magnetic Bead Single Plex Kit (货号:TGFBMAG-64 K-01)购自Merck 公司；IP-10 Monkey ProcartaPlexTMSimplex Kit(货号:EPX01 A-40284-901)、IFN-alpha Monkey ProcartaPlexTMSimplex Kit (货号:EPX01 A-40216-901)、ProcartaPlex NHP Basic Kit (货号:EPX010-40420-901) 购自Thermo Fisher 公司。 富马酸替诺福韦二吡呋酯片(TDF)购自倍特药业；拉米夫定片(3TC)购自上海迪泰诺药业有限公司；克力芝(Lpv/r)购自艾伯维公司。

1.3 实验方法

1.3.1 HAART 药物配制及动物给药方案

将拉米夫定片(3TC)、富马酸替诺福韦二吡呋酯片(TDF)、克立芝药片(Lpv/r)研磨成粉末。 按3TC 50 mg/kg,Lpv/r 15 mg/kg,TDF 20 mg/kg 的浓度取粉末分别溶于0.5 mL 的超纯水中。 配置好的药液分别与0.5 mL 30%的(2-羟丙基)-β-环糊精溶液混合,反复颠倒混匀至完全溶解。HAART 期间3TC 和TDF 每日肌肉注射给药一次,Lpv/r 每日肌肉注射给药两次,连续给药147 d 后停药观察。

1.3.2 样本采集

分别于感染前、HAART 治疗前及治疗过程中的第35 天以及停药后的第49 天采集EDTA 抗凝血。50 μL 全血用于流式检测T 淋巴细胞亚群。 血浆用于检测血浆病毒载量和细胞因子。

1.3.3 血浆病毒载量测定

取140 μL EDTA 抗凝血浆,使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取血浆病毒RNA,利用Real-time RT-PCR 方法检测血浆病毒载量[7]。

1.3.4 外周血T 淋巴细胞亚群检测

取50 μL 混匀的EDTA 抗凝血依次加入PerCPCD3、FITC-CD4、PE-CD8 抗体；孵育、裂红、洗涤过滤后。 使用Truecount 管上机检测CD4+T 细胞绝对数及CD4+/CD8+比值[8]。

1.3.5 血浆细胞因子测定

多因子检测试剂盒在使用前室温平衡,按照说明书准备实验试剂,冻存的血浆样本解冻后涡旋混匀。 准备完成后每孔加入200 μL Assay Buffer 室温震荡10 min,弃去Assay Buffer；标准孔加入25 μL标准品,对照孔每孔加入25 μL 对照品,背景孔和样品孔加入25 μL Assay Buffer；背景孔、标准孔和对照孔每孔加入25 μL matrix solution,样品孔加入25 μL样本后再加入25 μL Mixed Beads；贴上封口膜锡箔纸包被后置于摇床上室温孵育2 h,洗涤两次；每孔加入25 μL 检测抗体置于摇床上室温孵育1 h；加入25 μL PE 标记的链霉亲和素,置于摇床上室温孵育30 min,洗涤2 次；每孔加入100 μL Sheath Fluid 摇床震荡5 min,用Bio-Plex200 Luminex 仪器检测结果。

1.4 统计学方法

使用BD Accuri C6 Software 对流式数据进行分析, Prism Graph Pad 8 软件进行统计分析和作图。细胞因子与疾病指征数据进行相关性分析,P＜0.05表示有显著性差异。

2 结果

2.1 HAART 治疗SIVmac239 感染恒河猴血浆病毒载量检测结果

HAART 治疗前,SIVmac239 感染猴处于慢性感染阶段,血浆病毒载量在105～106copies/mL 水平。HAART 治疗中的第35 天,血浆病毒载量就全部转阴。 停药后血浆病毒载量依次反弹,第49 天达到105copies/mL 左右的水平(见图1)。

2.2 HAART 治疗SIVmac239 感染恒河猴外周血CD4+T 计数和CD4+/CD8+结果

图1 HAART 治疗SIVmac239 感染恒河猴血浆病毒载量结果Figure 1 Plasma viral load measurements in rhesus monkeys during HAART treatment

HAART 治疗前实验猴外周血CD4+T 细胞计数为每微升(699±360)个,HAART 治疗中CD4+T 细胞计数升高,在治疗第35 天增加到每微升(1877±767)个,HAART 治疗停止以后,CD4+T 细胞数又逐渐减少,到停药后49 d,减少到每微升(651 ±305)个。

外周血CD4+/CD8+比值在HAART 治疗中有小幅度升高,停药后的一段时间基本维持不变。 治疗前实验猴外周血CD4+/CD8+比为(1.29±0.52),HAART 治疗期间外周血CD4+/CD8+细胞比值为(1.47±0.58),停药以后在CD4+T 细胞计数下降的情况下实验猴CD4+/CD8+比值基本保持稳定为(1.53±0.57)(见图2)。

2.3 HAART 治疗SIVmac239 感染恒河猴外周血细胞因子浓度的变化

感染后血浆中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的浓度较未感染前有所升高,HAART 治疗中持续升高；治疗的第35 天达分别达到感染前的3.51、4.58和2.57 倍。 停药后IL-1β、IL-6 浓度比治疗过程中稍有降低,但仍高于治疗前,TNF-α 则继续升高。 在停药的第49 天三种促炎因子的浓度分别是感染前的2.07、2.26 和4.44 倍(见图3A)。

血浆中抑炎因子IL-10 和TGF-β1 在感染治疗过程中与促炎因子有相似的变化。 感染后浓度显著升高,HAART 治疗过程中继续升高。 治疗的第35 天分别达到感染前的4.23 和4.74 倍,停药以后IL-10 和TGF-β1 的血浆浓度缓慢下降但仍高于治疗前的水平,在停药的第49 天仍分别达到感染前的3.57 和3.31 倍(见图3B)。

图2 SIVmac239 感染恒河猴HAART 治疗前后外周血CD4+T 细胞绝对数及CD4+/CD8+比值变化Note. A, Peripheral CD4+ T cell count changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment. B, Peripheral CD4+/CD8+ ratio changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment.Figure 2 Peripheral CD4+T cell count and CD4+/CD8+ ratio changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment

趋化因子的变化趋势更加多样化。 IP-10 在感染后浓度量有所增加,经HAART 治疗恢复到正常水平,停药以后又有小幅度的反弹。 趋化因子MCP-1 在感染和治疗中持续升高在HAART 后的第35 天达到感染前的2.79 倍,停药以后小幅度下降。MIP-1β 是唯一在疾病过程中保持持续升高的趋化因子在停药后第49 天达到感染前的3.22 倍,但在HAART 治疗期间可以观察到升高的趋势放缓(见图3C)。

抗病毒因子IFN-γ 和IFN-α 与促炎因子TNF-α有相似的变化趋势,在感染和治疗阶段及停药后持续升高,但IFN-α 浓度升高的幅度更大。 抗病毒因子IFN-γ 在HAART 治疗的第35 天达到感染前的1.81 倍,在停药的第49 天浓度为感染前的3.21倍。 IFN-α 在HAART 治疗的第35 天浓度为感染前的2.36 倍,在停药的第49 天达到感染前的3.38 倍(见图3D)。

图3 SIVmac239 感染恒河猴HAART 治疗前后外周血中细胞因子浓度的变化Note. A, Changes in plasma proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α during HAART treatment and drug withdrawal. B, Changes in plasma anti-inflammatory factors IL-10 and TGF-β1 during HAART treatment and withdrawal. C, Changes in plasma chemokines IP-10, MCP-1,and MIP-1β during HAART treatment and withdrawal. D, Changes in plasma pro-apoptotic growth factor IL-2 during HAART treatment and withdrawal Change. E, Changes in plasma antiviral factors IFN-γ and IFN-α during HAART treatment and withdrawal.Figure 3 Changes in expression levels of cytokines in peripheral blood from rhesus monkeys infectedwith SIVmac239 during HAART treatment

促淋巴细胞生长因子IL-2 从感染开始到HAART 治疗阶段持续升高。 在治疗的第35 天达到感染前的5.61 倍,停药以后浓度稍有下降,停药后49 天时仍为感染前的2.79 倍。

2.4 HAART 治疗SIVmac239 感染恒河猴血浆细胞因子与疾病指征的相关性结果

促炎因子中IL-6 的血浆浓度与血浆病毒载量的相关性最好(r=-0.69, P=0.020),IL-1 β 与血浆病毒载量的相关性次之(r=-0.61, P=0.042),TNF-α 与血浆病毒载量没有相关性(r=-0.16, P=0.346)；几种促炎因子与CD4+T 细胞计数和CD4+/CD8+比均没有相关性。 抑炎因子TGF-β1 的浓度与血浆病毒载量存在强的负相关性(r=-0.69, P=0.019),IL-10 与血浆病毒载量没有显著的相关性；两种抑炎因子与CD4+T 细胞计数和CD4+/CD8+均没有显著的相关性。 趋化因子中仅IP-10 与血浆病毒载量存在强的正相关性(r=0.61, P=0.041),MCP-1 和MIP-1β 与病毒载量均没有显著相关性；三种趋化因子与CD4+T 细胞计数均没有显著的相关性,仅MIP-1β 与CD4+/CD8+比值存在强相关性(r=0.63, P=0.003)。 促淋巴细胞生长因子IL-2,抗病毒因子IFN-γ 和IFN-α 与疾病指征没有显著的相关性(见表1)。

3 讨论

近年来,不断优化的HAART 治疗方案虽然已经能在很大范围内控制HIV-1 感染者的血浆病毒水平,但多种细胞因子持续高浓度状态被认为是导致多种非HIV 定义性疾病及影响艾滋病的进展和治疗效果的重要因素。 很多研究也认为,促炎因子、抑炎因子、趋化因子、抗病毒因子等都对艾滋病的疾病进展有一定影响。

本研究发现,恒河猴血浆细胞因子的浓度在SIVmac239 感染后均有所升高,但在HAART 治疗期间,包括促炎因子IL-1 β、IL-6、抑炎因子IL-10、TGF-β1 和促淋巴细胞生长因子IL-2 在内的大部分血浆细胞因子的浓度没有伴随着病毒水平的下降而降低,而是呈现出持续增高的态势。 反而在停止HAART 治疗后,逐渐下降,但下降的幅度不大,浓度基本维持在HAART 治疗前的水平,仍明显高于感染前。 促炎因子TNF-α、抗病毒因子IFN-α 和IFN-γ在感染后一直呈现持续增高的走势。 趋化因子IP-10 在HAART 过程中下降,停药后稍有反弹,MCP-1及MIP-1 β 自感染后基本维持不变。

表1 HAART 治疗SIVmac239 感染恒河猴血浆细胞因子与疾病指征的相关性Table 1 Correlations between plasma cytokines and disease indicators in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment

另外,本研究还发现促炎因子IL-1 β 和IL-6、抑炎因子TGF-β1、趋化因子IP-10 的血浆浓度与血浆病毒载量存在一定的相关性。 Worley M 等人最近发现中性粒细胞可以通过介导HIV 特异性抗体依赖的ADCC 作用和抗体依赖的中性粒细胞吞噬作用清除血浆病毒颗粒[9]； IL-1 β 可以促进骨髓中性粒细胞释放入血,IL-6 可以通过STAT3 途径激活中性粒细胞促进其迁移能力[10]。 推测促炎因子IL-1 β和IL-6 可能通过增强中性粒细胞功能的途径,间接产生清除血浆中病毒颗粒的作用。 TGF-β1 主要由活化的CD8+T 细胞产生,其主要功能是抑制炎症和组织修复[11]；因此,TGF-β1 与血浆病毒载量的相关性可能与TGF-β1 本身的功能无关,而是由病毒感染后抗病毒作用的CD8+T 细胞活化增加分泌TGFβ1 的能力增强引起的。 IP-10 可以直接刺激HIV在外周血CD4+T 淋巴细胞和巨噬细胞内复制[12]。对于清除血浆病毒载量来说IL-1 β、IL-6、IP-10 这几种细胞因子可能更具有研究的价值。 趋化因子MIP-1β 的血浆浓度与CD4+/CD8+比值相关,这个因子可能对于方便快速的检测外周血T 淋巴细胞亚群紊乱有一定意义。

综上所述,HAART 治疗前SIVmac239 感染的恒河猴血浆细胞因子的变化趋势与临床病人基本一致。 HAART 治疗中有部分细胞因子的变化趋势与临床一致,其中IL-6、TGF-β1、IP-10 的浓度无论变化趋势还是与疾病指征的相关性都与临床相符合[13-15]。 这为临床进行艾滋病免疫激活造成的免疫重建失败及其他并发症研究提供了动物模型支持。