野生瑶山亚种树鼩粪便潜在病原细菌的调查及耐药性分析

梁 亮,贾蒙纲,金 伟,曹颖颖,唐海波*,冷 静*

(1.广西中医药大学,南宁 530200； 2.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室 南宁 530200)

树鼩(tree shrew,Tupaia belangeri)是树鼩科树鼩属动物,为哺乳动物,主要生活在热带、亚热带地区,是一种具有良好潜力的实验动物模型。 树鼩作为新型实验动物在特定药物研发中有着独特优势,从解剖学分析,树鼩的免疫系统、内分泌系统和神经系统的组织形态特征与灵长类有很高的相似度[1]。 树鼩全基因组与多个物种基因组比较分析证实了树鼩与灵长类亲缘关系最为接近。 此外树鼩与人类在生理机能、生化代谢和基因组等方面的相似性远高于大鼠、小鼠、土拨鼠等常用啮齿类动物。 树鼩的许多分子和细胞结构近似人类,同时树鼩个体小,易于操作,价格相对便宜等优点,性成熟时间比较短,饲养方法简单且繁殖较快[2]。 因此树鼩有望代替灵长类动物作为某些人类重大疾病研究的动物模型,具有广泛的应用前景[3-7]。

树鼩是一种形似松鼠的小型哺乳动物,我国树鼩分布于中国南部和西南部,统属于中缅树鼩(Tupaia belangeri chioensis),具有6 个亚种。 滇西亚种(T. b. chinensis),也就是目前我国研究最广泛最多的一个种类,分布于云南西部、中部和南部以及四川西南部。 其他的树鼩还包括高黎贡山亚种(T.b. gaoligongensis)、海南亚种(T. b. modesta)、越北亚种(T. b.toninia)、滇南亚种(T. b. yunalis)和瑶山亚种(广西西北部)( T. b. yaoshanensis)[8]。

广西瑶山亚种树鼩是广西的一个特色的物种资源,具有重要开发潜力的实验动物,主要分布在广西金秀等地。 瑶山亚种树鼩与中缅树鼩其他亚种的外形有较大的差异,其体型是我国6 种中缅树鼩亚种中最大的,成年体重为150～250 g,体长14.0～19.5 cm。 并且其生物学特性如乳酸脱氢酶(LDH)同功酶等与其他亚种存在较大的差异[9],在其饲养和繁殖等方面,仍有许多问题未解决,树鼩对生长环境要求较高,消化道传染病多,致死率较高,且其繁殖的数量较低。 关于广西瑶山亚种树鼩的饲养、疾病等的相关文献报道较少,对野生瑶山亚种树鼩肠道细菌的种群分布情况,携带致病菌资料处于空白状态。 因此我们开展了瑶山亚种树鼩粪便可培养细菌的分离与鉴定,了解野外捕获的野生瑶山亚种树鼩粪便菌群的多样性和潜在的致病性,为瑶山亚种树鼩的隔离检疫、实验室饲养及常见消化道疾病的防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

野生瑶山亚种树鼩来自广西金秀瑶族自治县动物疾病预防控制中心用捕鼠笼捕获的当地森林野生一周年左右健康瑶山亚种树鼩,公母随机,毛色光亮,体型匀称,体重在131～248 g 之间,共19 只成年瑶山亚种树鼩。 运送至广西中医药大学人工驯化养殖实验中心[SYXK(桂)2019-0001],经由广西伦理审查委员会审查通过(GXIRB 2018-0006),动物使用遵循3R 原则。

1.2 主要试剂与仪器

超净工作台(型号:SW-CJ-2FD)购自苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；生化培养箱(型号:LRH-150F)购自上海一恒科学仪器有限公司；TIANGEN 细菌总DNA 提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；SS 培养基、伊红美蓝培养基、血琼脂培养基、营养肉汤培养、琼脂粉等购自北京陆桥技术股份有限公司；常用药敏试纸:庆大霉素(10 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、复方新诺明(30 μg)头孢挫林(30 μg)、头孢西叮(30 μg)、头孢他啶(30 μg)、红霉素(15 μg)、青霉素(10 U)、氨苄西林(10 μg)购自杭州滨和微生物试剂有限公司,其他常规试剂均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 粪便标本采集及处理

所有粪便标本采集及处理相关设施均高压灭菌处理后,分别用灭菌的镊子采集19 只新捕获的野生瑶山亚种树鼩喂食后4 h 的新鲜粪便,每一只树鼩的粪便单独编号,并分成两份,一份取豌豆粒大小至10 mL 灭菌的离心管中,加医用生理盐水5 mL,震荡混匀后再低速离心1 min,取上清,置-80℃或进行下一步实验,一份直接置-80℃。

1.3.2 细菌的初步分离

将每份粪便上清分别在麦康凯(MAC)培养基和伊红美蓝(EMB)培养基上进行分区划线,置于生化培养箱37℃倒置培养24～48 h。 根据培养后菌落形态、颜色及溶血等特性,初步排除鉴定或怀疑为大肠杆菌的菌落,挑取除大肠杆菌外的单个优势菌落,并进行重复划线纯化培养,直到菌落的形态特征一致。 并挑取菌落进行革兰氏染色、镜检及纯化,最后接种至营养肉汤培养基中增菌培养,4℃冰箱保存备用或20%的甘油保存至-80℃。

1.3.3 细菌的革兰染色

对分离的细菌进行按照说明书进行革兰染色并在油镜下进行镜检,记录所以菌株革兰染色结果和细菌的形态特征。

1.3.4 细菌的分子生物学鉴定

用TIANGEN 细菌总DNA 提取试剂盒提取分离细菌的总DNA。 采用16S rRNA 通用引物27F/1429R,以细菌总DNA 为模板进行PCR 扩增并送上海生物工程有限公司测序。 测序结果在NCBI 上BLAST 比对,并鉴定细菌的种类。 将分离致病菌16S rRNA 基因序列与GenBank 数据库中的相关核酸序列进行Blast 比对分析,并应用MEGA 7.0[10]软件中Maximum likelihood 法构建系统进化树,进行遗传进化分析。

1.3.5 细菌的药敏实验方法(纸片扩散法)

将在试管里培养好的细菌通过移液枪吸取100 μL 转移到营养琼脂培养基中,立刻用三角形无菌推棒涂布之后,将药敏试纸贴于培养基表面并轻轻按压使之贴紧呈三角形,室温放置15 min 后入培养箱培养。 分别贴上相应的药敏试纸。 在37℃下培养24 h 后,观察结果并测量抑菌圈大小(mm)。

2 结果

2.1 16S rRNA 序列分析结果

图1 野生瑶山亚种树鼩粪便分离的细菌初步排除大肠杆菌后检出情况Figure 1 Detection of bacteria isolated from the feces of wild T.b. yaoshanensis after Escherichia coli was preliminarily excluded

排除初步鉴定或怀疑为大肠杆菌的菌落,剩下的细菌经过16 s rRNA 序列分析,从19 只树鼩中分离鉴定得到7 科13 属20 种共35 株细菌(见图1、表1)。 包括肠杆菌科、细球菌科、气单胞菌科、球杆菌科、芽孢杆菌科、假单胞菌科、微杆菌科共7 科的相关细菌。 检出率最高的为肠杆菌科细菌占68.57%,其中大肠埃希氏菌31.58%(6/19)和弗氏柠檬酸杆菌26.32%(5/19)的检出率最高。 其次为奇异变形杆菌、气单胞菌属、松鼠葡萄球菌等；其他检查的细菌包括假单胞菌属、雷氏普罗威登斯菌、气单胞菌属、溶血葡萄球菌等。 先前的报道包括弗氏柠檬酸杆菌[11-12]、奇异变形杆菌[13]、气单胞菌属[14]、松鼠葡萄球菌[15]、假单胞菌属[16]、雷氏普罗威登斯菌[17]等都可能成为条件性致病菌,同时也可能造成人畜共患性感染。 这些优势菌种的检出,这为广西野生瑶山亚种树鼩粪便菌群的多样性和潜在的致病性提供了第一手资料,为瑶山亚种树鼩的隔离检疫及实验室饲养、常见消化道疾病的防治提供科学依据。

2.2 瑶山亚种树鼩粪便分离的细菌初步排除大肠杆菌后细菌遗传进化树

排除初步鉴定或怀疑为大肠杆菌的菌落,剩下的细菌根据16S rRNA 测序结果,运用MEGA 7.0 软件Maximum likelihood 的方法建立细菌的种系遗传进化树,确定35 株细菌在分子生物学分类学的进化关系和亲缘关系(图2)。 所有的细菌大体分为7 个分支,有细菌的分科大体一致,相关细菌或多或少都有一定的亲缘关系,说明物种肠道菌群的分布或许跟该物种进化有一定的关系。

2.3 瑶山亚种树鼩粪便分离的细菌常见抗生素的药敏实验。

为了了解瑶山亚种树鼩肠道细菌对药物的敏感与耐药情况,本研究对分离得到的部分肠道细菌进行药物敏感性实验,常见药物对瑶山亚种树鼩肠道阴性菌敏感多,阳性菌耐药多。 瑶山亚种树鼩肠道分离细菌对头孢唑啉药敏实验结果显示,耐药率为59%,中介占17%,敏感占24%；头孢西丁,耐药率为38%,中介占3%,敏感占59%；头孢他啶,耐药占28%,中介占3%,敏感占69%。 红霉素、氨苄西林及复方新诺明对瑶山亚种树鼩肠道部分分离细菌的敏感性显示,耐药率均大于敏感率；青霉素对瑶山亚种树鼩肠道部分分离细菌的敏感性显示,耐药率等于敏感率；庆大霉素及左氧氟沙星对瑶山亚种树鼩肠道部分分离细菌的敏感性显示,敏感率均大于耐药率(具体见表2)。今后瑶山亚种树鼩发生消化道相关疾病时,建议可采用如庆大霉素、左氧氟沙星及头孢他啶类抗生素治疗。

表1 瑶山亚种树鼩粪便分离的细菌初步排除大肠杆菌后16S rRNA 序列分析结果Table 1 The results of 16S rRNA sequence analysis of bacteria isolated from the feces of T.b. yaoshanensis after Escherichia coli was preliminarily excluded

3 讨论

野生瑶山亚种树鼩粪便分离的细菌初步排除大肠杆菌后,细菌经16S rRNA 序列分析,共鉴定出7 科13 属20 种共35 株可培养细菌,其中肠杆科7属24 株细菌分别为:克吕沃尔氏菌属,肠杆菌属、泛菌属、枸橼酸杆菌属、埃希氏菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属。 据报道[18]变形杆菌是引起树鼩腹泻和死亡的常见菌。

高家红等[19]关于树鼩正常肠道细菌的研究显示,大肠杆菌、葡萄球菌菌群及链球菌菌群的检出率较高,本实验结果存在差异。 可能前者其结果主要是分离鉴定正常肠道细菌,与本文采用的分离与鉴定的野生的瑶山亚种树鼩粪便细菌有一定的差异,此外也可能跟树鼩的种类、驯化程度、饲料及环境有关,所以掌握野生瑶山亚种树鼩肠道细菌种类及多样性的情况,为本驯养中心今后相关疾病的防治提供科学依据。

本实验动物来自于广西野生瑶山亚种树鼩,受环境和地理因素等影响导致树鼩体内肠道菌群有一定差异,同时树鼩检测数量还不是很多,今后应进一步增加检测的实验树鼩数量,在不同时间再次进行培养。 下一步将深入开展瑶山亚种树鼩驯化过程中优势菌群的动态监测,特别是通过检测粪便中细菌的变化情况,了解瑶山亚种树鼩在驯化过程中不同部位菌群在种群分布、数量的变化。 以期找出瑶山亚种树鼩的优势菌群及与疾病相关的生物物种标记。 同时对引起瑶山亚种树鼩内源性与外源性感染的微生物的研究,初步建立瑶山亚种树鼩实验动物微生物质量控制体系,为今后建立相应的瑶山亚种树鼩病原微生物检测地方标准提供科学依据。

表2 树鼩肠道细菌对常见抗生素药敏实验结果Table 2 Sensitivity experiment results of intestinal bacteria of the tree shrew to common antibiotics

通过头孢类药物对瑶山亚种树鼩肠道细菌敏感性分析,发现头孢唑啉耐药率最高、头孢西丁次之、头孢他啶对细菌的敏感程度最高。 这与头孢类抗菌素的抗菌原理和使用频率相符合。头孢唑林是一代头孢类药物、头孢西丁是二代头孢类药物、头孢他啶为三代头孢类药物。 一代头孢对大肠埃希菌、变形杆菌等肠杆菌普遍有抑制作用,而本研究发现有1 株大肠杆菌、1 株弗氏柠檬酸杆菌、1 株变形杆菌对头孢西丁耐药。 耐药的机制和原因未明,这将是将来我们重点关注的问题之一。 头孢类药物对肠球菌没有作用这一结果与文献报道中的结论相符,因此在实际工作中更应该注意根据细菌类型选用适合的抗菌药物来治疗感染。

针对革兰阳性的球菌和杆菌,本研究进一步选用了红霉素、青霉素和氨苄西林进行药敏实验,结果表明肠球菌对这三种药物的耐药率高,红霉素、氨苄西林尤为明显,达到83%,青霉素次之。 说明肠球菌易产生耐药性。

针对革兰阴性菌,本研究进一步选用了庆大霉素、左氧氟沙星和复方新诺明三种药物进行药敏实验,结果表明瑶山亚种树鼩肠道阴性菌对庆大霉素和左氧氟沙星敏感,而对复方新诺明耐药率达92%。 而对庆大霉素、左氧氟沙星普遍敏感。 大肠埃希菌、弗氏柠檬酸杆菌、肠球菌均是肠道的长居菌,而菌群的耐药性改变有可能是引起内源性感染的原因之一。 通过本研究表明,瑶山亚种树鼩肠道细菌对头孢唑林、头孢西丁、红霉素、氨苄西林、复方新诺明均存在不同程度的耐药的菌株,而对左氧氟沙星、庆大霉素和青霉素的耐药菌较少。 这提示我们在进行实验动物病原微生物监测的时候,不仅仅要关注野生瑶山亚种树鼩引起人畜共患病的病原体的感染情况,也应该重视一些长居菌群在种类、耐药性变异情况的监测。

广西野生瑶山亚种树鼩粪便分离鉴定的菌落,经16S rRNA 序列分析,共鉴定出7 科13 属20 种细菌,包括豚鼠气单胞菌、假单胞菌、雷氏普罗威登斯菌、弗氏柠檬酸杆菌、奇异变形杆菌、费革森埃希菌、坚强芽孢杆菌、普通变形杆菌、羽状变形杆菌、普罗威登斯菌、松鼠葡萄球菌、溶血葡萄球菌等多种常见致病或条件性致病菌。 在树鼩特别是瑶山亚种树鼩消化道,这些潜在的病原细菌绝大多数都是首次报道,本研究为野生瑶山亚种树鼩的驯养及相关疾病的防治提供科学依据。