HPD型树脂纯化肉桂枝叶非挥发部分多酚的工艺研究

钟益宁，蓝 富，钟成勇

（广西中医药大学，广西 南宁 530299）

肉桂又名玉桂，为樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥树皮，最早在《神农本草经》中记载，为临床常用的温里药[1]。肉桂作为药食两用药材，广泛应用于医药、食品、日化等领域[2-3]。对肉桂化学成分和药理作用的研究表明，肉桂含有丰富的多酚类化学成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调节血脂等多方面的药理作用[4-10]。为了进一步开发利用广西丰富的肉桂资源，充分利用肉桂枝叶丰富的多酚成分，变废为宝，本文对提油后非挥发部分残渣中含有的肉桂枝叶多酚（简称CBLP）进行富集纯化研究，以CBLP的吸附率与解析率为指标，比较了6种HPD型树脂对CBLP的静态吸附与解吸性能，筛选出最佳树脂并对其进行动态吸附和解吸实验，以确定其富集纯化CBLP的最佳工艺条件，为进一步开发利用肉桂枝叶残渣的多酚成分提供理论依据[11-14]。

1 试剂和仪器

1.1 药材

肉桂枝叶是提取桂油后的肉桂枝叶非挥发部分残渣经粉碎得到的粗粉。

1.2 仪器

LP302A型电子天平，电子分析天平，8453紫外可见分光光度计，RE-52系列旋转蒸发仪，TGL-16G离心机，KQ5200B超声波清洗仪，KQ-B玻璃仪器气流烘干器，DHG-9023A 电热恒温鼓风干燥箱，HH-S 恒温水浴锅。

1.3 药品和试剂

树脂 HPD100、HPD300、HPD450、HPD600、HPD750、HPD826，钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂、溴水、无水碳酸钠、甲醇、无水乙醇(均为分析纯)，蒸馏水，没食子酸对照品，磷酸盐缓冲液(pH=7.5)，福林酚试剂(按要求配制)。

2 实验方法

2.1 肉桂枝叶残渣提取液的制备

称取提油后的干燥肉桂枝叶粗粉200g，用30%、50%、70%的乙醇各0.5L为提取溶剂，依次回流提取，每次2 h。合并滤液，回收乙醇，以蒸馏水定容至 1000 mL（生药 /粗提液，200 mg·mL-1），备用。

2.2 Folin-Ciocelteu法测定CBLP含量

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取0.100g没食子酸标准品，加少量95%乙醇超声溶解，用蒸馏水定容至100 mL，取25mL定容至250mL，制备成0.1mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2 样品溶液的制备

取一定量的肉桂枝叶残渣提取液，用蒸馏水稀释 50倍（生药 /粗提液，4.0 mg·mL-1），用于测定其多酚浓度。

2.2.3 福林试剂的制备

10g钨酸钠和2.5g钼酸钠，用70mL纯净水溶于250mL烧瓶中，加入5.0mL磷酸和10mL浓盐酸混匀，微沸回流2h。加入15g硫酸锂、5.0mL纯净水和3滴溴水（边加边摇），开口沸腾15min（至溴水挥尽），放冷，用水定容至100mL，过滤，置于棕色瓶中保存。使用时加入1倍量的蒸馏水稀释。

2.2.4 标准曲线的绘制

准 确 吸 取 5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5mL标准溶液定容至50mL，分别得到浓度为10、15、20、25、30、35、40、45μg·mL-1的溶液。从上述溶液中，分别移取1.0mL加入福林试剂1.0mL、16%碳酸钠溶液3.0mL，定容至10 mL。以蒸馏水为空白，在765 nm处测定吸光度，得到没食子酸浓度(x)与吸光度(y)的线性回归方程为：y=0.0127x+0.0194，r2=0.9991，在10～45μg·mL-1浓度范围内，吸光度与质量浓度呈良好的线性关系。

2.2.5 CBLP含量的测定

取1.0mL样品溶液于10mL容量瓶中（生药/粗提液，0.4 mg·mL-1），按 2.2.4的方法测定吸光度，计算样品溶液中的多酚浓度。

2.3 树脂静态吸附和解吸实验

2.3.1 树脂预处理

分别称取6种HPD型树脂，先用蒸馏水浮选，然后依次用5%盐酸溶液浸泡24h，蒸馏水洗至中性，5%的氢氧化钠溶液浸泡24h，蒸馏水洗至中性，95%乙醇浸泡24h，蒸馏水洗至无醇味、无白色浑浊，备用。

2.3.2 上样溶液的制备

取一定量的肉桂枝叶残渣提取液，用蒸馏水分别稀释成 1/7、2/7、3/7、4/7、5/7 等倍数，浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg·mL-1，用于大孔树脂上样和吸附。

2.3.3 树脂的初筛

分别精密称取预处理的6种大孔树脂各1.0 g于锥形瓶中，分别加入3.0 mg·mL-1的提取液20mL，置于恒温振荡器，25℃下振荡12h。吸附平衡后取上清液测定。抽滤分离，精密称取1.0g吸附饱和的树脂于锥形瓶中，加入60%乙醇20mL，25℃下在恒温振荡器上振荡6h。取解吸液测定，按2.2.5方法，分别测定未吸附和解吸液的CBLP质量浓度，按式（1）、（2）、（3）计算树脂对 CBLP 的吸附量、吸附率和解吸率。

式中，C0为吸附前样液中CBLP的浓度，mg·mL-1；C1为吸附后上清液中CBLP的浓度，mg·mL-1；C2为解吸液中 CBLP 的浓度，mg·mL-1；W为树脂质量，g；V0为样品溶液的体积，mL；V1为吸附溶液的体积，mL；V2为解吸溶液的体积，mL。

2.3.4 理想树脂的筛选

根据吸附量、吸附率和解吸率，选择相对理想的HPD100和HPD750做进一步对比，考察样液浓度、吸附时间、样液pH以及洗脱剂浓度等因素的影响，优选出理想的树脂。

1）样液浓度的影响。精密称取5份经预处理的HPD100和HPD750树脂各1.0 g于锥形瓶中，加入 20mL 浓度分别为 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg·mL-1的CBLP溶液，置于恒温振荡器，25℃下振荡吸附12h，计算吸附量和吸附率，考察样液浓度对树脂吸附的影响。

2）吸附时间的影响。精密称取经预处理的HPD100和HPD750树脂各1.0g于锥形瓶中，加入20mL浓度为3.0mg·mL-1的CBLP溶液，置于恒温振荡器，25℃下振荡吸附。每隔1h取上清液测定多酚含量，计算吸附量和吸附率，考察吸附时间对树脂吸附的影响。

3）样液pH的影响。精密称取5份经预处理的HPD100和HPD750树脂各1.0 g于锥形瓶中，加入3.0mg·mL-1的CBLP溶液20mL，分别用盐酸调节溶液 pH 为 2、3、4、5、6，置于 25℃摇床振荡吸附12h。取上清液测定多酚含量，计算吸附量和吸附率，考察上样液pH对树脂吸附的影响。

4）洗脱剂浓度的影响。精密称取1.0g吸附饱和的HPD100和HPD750树脂各5份于锥形瓶中，加入30mL体积比浓度分别为10%、20%、40%、60%、80%的乙醇，25℃下恒温摇床解吸6h。取上清液测定CBLP的含量，计算解吸率，考察洗脱剂浓度对树脂解吸的影响。

2.4 动态吸附和解吸实验

在静态吸附和解吸实验的基础上，考察上样流速和洗脱液流速、用量对动态吸附和解吸的影响。

2.4.1 吸附流速的影响

HPD100树脂湿法装柱，上样浓度3.0mg·mL-1（pH=4），控制吸附流速分别为 1、2、3、4 BV·h-1。收集流出液，以10.0mL为1份，测定多酚含量，考察上样流速对动态吸附的影响。

2.4.2 解吸流速的影响

HPD100树脂湿法装柱，上样浓度3.0mg·mL-1（pH=4），动态吸附饱和的树脂用适宜浓度的乙醇（pH=4）洗脱，分别在2、3、4 BV·h-1流速下解吸。收集流出液，以10.0 mL为1份，测定多酚含量，考察洗脱流速对解吸的影响。

2.4.3 洗脱剂用量的影响

HPD100树脂湿法装柱，上样浓度3.0mg·mL-1（pH=4），动态吸附饱和的树脂先以3 BV·h-1流速水洗，再按2.3.4中确定的乙醇浓度（pH=4）洗脱，收集洗脱液，测定多酚含量，考察洗脱剂用量对动态解吸及多酚收率的影响。

2.5 树脂筛选的验证

按照上述筛选的上样浓度（3.0mg·mL-1）、速度（3BV·h-1）、pH（pH=4）、洗脱剂浓度（60% 乙醇）、洗脱速率（3 BV·h-1）、用量（4BV），对 CBLP 进行纯化实验，平行3次，洗脱液CBLP含量按2.2.4的方法测定。回收溶剂，冻干，制得CBLP纯化样品，验证筛选结果的可行性。

2.6 动态吸附和解吸的放大实验

参照2.5的方法进行富集纯化放大实验。以过量20%～50%的上样量，重复上样吸附饱和，用蒸馏水6BV洗去残留液体，然后用4 BV的 60%乙醇洗脱，测定洗脱液中CBLP的含量。回收溶剂，冻干，制得CBLP纯化样品，考察放大实验的可行性，为工业生产提供依据。

3 结果与分析

3.1 树脂的初筛结果

影响树脂吸附性能的因素较多，通常树脂具有较大的比表面积、合适的孔径、极性与被吸附分子的极性相同或相近时，会有较好的吸附效果。由表1可知，所选的6种HPD树脂对CBLP的吸附及解吸率差异明显， HPD750、HPD100、HPD826 和 HPD600对CBLP具有较强的吸附能力，吸附率都高于70%，吸附能力依次为HPD750＞HPD100＞HPD826＞HPD600＞HPD300＞HPD450，其中HPD750的吸附率最高。解吸能力依次为HPD300＞HPD600＞HPD750＞HPD100＞HPD826＞HPD450，解吸效果较好的树脂是HPD300和HPD600。HPD300的解析率最高，但其吸附率较低；HPD100、HPD750树脂的吸附率、吸附量以及解析率都较高。综合考虑，选择HPD750、HPD100 型大孔树脂做进一步的对比实验。

表1 6种树脂对CBLP的静态吸附性能(n=3)

3.2 理想树脂的筛选

3.2.1 样液浓度的考察结果

样液浓度的实验结果见表2。数据表明，2种树脂对CBLP的吸附量，在一定范围内随样品浓度的增大而增大；浓度为3.0mg·mL-1时，2种树脂的吸附量最大，分别为1.73mg·g-1和1.77 mg·g-1；浓度继续增大，由于吸附饱和，吸附率反而有所下降，表明上样浓度控制在3.0 mg·mL-1左右为宜。

表2 样液浓度对吸附的影响

3.2.2 吸附时间的考察结果

吸附时间的实验结果见表3。数据表明，所选树脂对CBLP的吸附均为快速吸附平衡型，1～2h，树脂吸附量增加明显，1～4h，均基本达到较高的吸附量，吸附8h时，二者均基本达到饱和吸附量。对比后可以发现，HPD100达到平衡吸附量的时间比HPD750更短，而在所测的时间范围内，两者的吸附量和解吸率相近，理论上2种树脂都可以用于CBLP的富集纯化工艺研究。

表3 吸附时间对吸附的影响

3.2.3 样液pH的考察结果

样液pH的实验结果见表4。数据表明，pH值为2～6的酸性条件下，2种树脂对CBLP的吸附量都比较大，HPD750树脂在pH=2时的吸附量最大，HPD100树脂在pH=4时的吸附量最大，表明酸性条件下，多酚类可能以分子状态存在，有利于吸附，但是酸性条件太强会对后处理不利，且容易产生废酸。综合考虑，确定理想的溶液pH为4，并确定将HPD100树脂用于后续实验。

表4 样液pH对吸附量的影响

3.2.4 洗脱剂浓度的考察结果

洗脱液浓度的实验结果见表5。数据表明，HPD100树脂对CBLP的解吸率随着乙醇浓度的增大而增大，用60%乙醇洗脱的解吸率达到11.4%，而80%乙醇的解吸率只有5.5%。为避免更多杂质的残留以及节约试剂成本，使用60%的乙醇作为洗脱液。

表5 洗脱剂浓度对解吸率的影响

3.3 动态吸附及解吸实验结果

3.3.1 吸附流速的考察结果

吸附流速的实验结果见表6。数据表明，流速影响泄漏点的出现，流速过快，多酚来不及吸附扩散就被样液洗出，泄漏点前移，吸附量降低。上样流速小有利于吸附，但流速变化的影响不显著。考虑到上样流速越小，耗时越长，因此选择上样流速为3 BV·h-1。

表6 吸附流速对吸附率的影响

3.3.2 洗脱流速的考察结果

洗脱流速的实验结果见表7。数据表明，洗脱率在流速为1～2BV·h-1时变化不显著，之后随流速的增加，洗脱率下降。考虑到时间因素，选择洗脱流速为3BV·h-1。

表7 洗脱流速对洗脱率的影响

3.3.3 洗脱剂用量的考察结果

洗脱剂用量的实验结果见表8。结果表明，先水洗至洗脱液挥干无固体，再用60%乙醇洗脱，洗脱剂体积为4 BV时，CBLP基本洗脱完全，表明肉桂多酚容易被洗脱。合并多酚含量较高的洗脱液，回收率可达到46.2%，因此选择4 BV为适合的洗脱剂用量。

表8 洗脱剂用量对多酚含量的影响

3.3.4 树脂筛选的验证结果

按2.5的操作方法，合并多酚含量较高的1～3 BV的洗脱液，测得其含量分别为44.9%、46.6%、46.1%，均值为46.2%，表明HPD100树脂可用于富集和纯化CBLP。

3.3.5 动态吸附和解吸的放大实验

在放大实验中，我们忽略泄漏点因素，采取过量20%～50%的上样量，采用重复上样的方式进行操作，让树脂吸附饱和，达到最大吸附量，避免因操作问题提前泄漏，影响吸附效率。结果证明这样的操作效果很好。按2.6的操作方法，吸附率达81.0%。合并多酚含量较高的1～4 BV洗脱液，测得其含量为45.6%。挥干得红棕色黏稠状固体，出膏率（解吸率）为79.5%。结果表明，HPD100树脂适合用于富集、纯化大批量的CBLP。

4 结论

大孔树脂分离技术是利用其存在的多孔结构和选择性吸附功能，从中药提取液中分离、纯化、富集有效成分。树脂孔径、比表面积、分子间作用等因素决定其吸附性能。对6种HPD型树脂的静态吸附、动态吸附和解吸行为进行研究，筛选出了对CBLP有较好的分离、富集和纯化作用的HPD 100树脂。优选的工艺条件为：上样量60mg·g-1，上样浓度 3.0mg·mL-1，上样 pH=4.0，吸附时间 3h，洗脱剂为60%乙醇。动态实验时，先用6 BV水洗至挥干无固体，再以4BV的60%乙醇以3BV·h-1的流速洗脱，洗脱液多酚含量达46.2%。放大实验中，纯化得红棕色黏稠状固体，出膏率为79.5%，多酚含量达45.6%。因此可以认为，HPD100型树脂对CBLP具有良好的吸附选择性，具有吸附快、解吸率高、可多次重复使用、工艺稳定等特点，适宜于CBLP的富集和纯化，可为肉桂枝叶多酚的开发利用研究和工业生产提供理论依据。