蛇床子素对慢性坐骨神经压迫模型大鼠背根神经节中MyD88、p-ERK表达的影响

温超，王春梅，杨柳

（大连医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁 大连 116011）

蛇床子素是中药蛇床子主要有效成分，具有神经保护、抗炎和免疫调节的作用［1-2］。有研究［3］发现硬膜外腔注射蛇床子素能够缓解髓核引起的坐骨神经痛大鼠的疼痛行为。慢性坐骨神经压迫 （chronic constriction injury of the sciatic nerve，CCI） 模型是研究外周神经不完全损伤的病理性疼痛的动物模型［4］。髓样分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）是Toll样受体 （Toll-like receptor，TLR） 信号通路中的关键接头分子，CCI模型大鼠能够激活MyD88依赖性信号通路，引起下游蛋白细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK） 激活为磷酸化ERK （phosphated ERK，p-ERK）［5］。研究［6］显示蛇床子素能够通过抑制脊髓背角p-ERK活化下调COX-2mRNA表达，对髓核导致的神经根炎性痛发挥明显的镇痛作用。本研究检测蛇床子素治疗后CCI大鼠背根神经节 （dorsal root ganglion，DRG） 中MyD88与p-ERK表达变化，旨在明确蛇床子素缓解慢性神经病理性疼痛的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂、动物及分组

蛇床子素 （美国Selleck Chemicals公司），β-actin抗体、MyD88抗体 （英国Abcam公司），ERK和p-ERK（美国Cell Signaling 公司）。24只SD大鼠 （180～200 g，雌性） 由大连医科大学附属第一医院动物实验中心提供，并获得大连医科大学动物管理伦理委员会批准。大鼠自由饮水，鼠粮充足，每天照明12 h/关灯12 h，适宜温度、湿度饲养。大鼠在进行行为学实验前适应测试环境1 h。实验大鼠随机分为3组：假手术组 （sham组）、CCI组、治疗组，每组8只。手术后14 d完成动物行为测试，然后进行DRG取材。

1.2 CCI模型制作

在CCI手术前，掀开大鼠L6的硬脊膜，沿蛛网膜下腔向头端置入 PE-10导管 （美国Smiths Medical International公司） 约5 cm，随后缝皮固定导管，1 d后进行坐骨神经结扎手术。大鼠腹腔注射l%戊巴比妥钠后麻醉，参照Bennett-Xie模型制作CCI模型［4］。暴露右侧坐骨神经干后用4-0铬制羊肠线围绕其进行4个结扎环，结扎环之间间隔1 mm。sham组大鼠只暴露不做结扎。治疗组硬膜外注射50 μL蛇床子素［溶于二甲基亚砜，体积浓度为2% （20 mg/mL）；美国Sigma公司］。3组大鼠均进行相同鞘内置管，相同给药时间sham组与CCI组大鼠注射相同体积的生理盐水。大鼠术后均注射青霉素预防感染。

1.3 大鼠机械疼痛阈值测定

将待测大鼠放在一个长方体的有机玻璃盒中，放在金属网格上。用Von Frey电子测痛仪 （美国 IITC Life Science公司） Von Frey丝 （直径200 μm） 垂直刺激大鼠的右后足，观察大鼠的缩足反应 （右后足缩足、舔足或扬足反应为阳性反应），使用后足机械缩足阈值 （paw mechanical withdrawal threshold，PMWT）评价大鼠对机械刺激所产生的疼痛。机械刺激间隔时间＞10 min，反复测量3次，取平均值。

1.4 大鼠热痛阈值测定

将大鼠放在透明玻璃笼 （底部厚为0.22 mm，20 cm×20 cm×40 cm） 中，下面放一块薄玻璃板，使用热辐射刺激器 （天津BME-410C，伯尔尼科技有限公司） 距离玻璃板15 cm聚焦大鼠足底，大鼠缩足、扬足或舔足等行为为阳性反应，从刺激开始至出现阳性反应时间为后足热缩足反射潜伏期 （paw thermal withdrawal latency，PTWL），用它来表示热痛阈值。刺激间隔时间＞15 min，反复测量3次，取平均值。为防止烫伤大鼠足部皮肤，设20 s为最高阈值。

1.5 Western blotting检测

将大鼠麻醉后取右侧 L4和L5的DRG。蛋白上样量为30 μg，使用12%浓度的分离胶进行电泳，转膜1 h到PVDF （4 ℃） 上，使用TBST冲洗3次，每次5 min，共15 min；接着用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h（室温），然后用一抗MyD88抗体 （1 ∶500） 孵育过夜 （4 ℃），第2天TBST洗3次，每次15 min，之后使用二抗 （1 ∶1 000） 室温孵育1 h，使用ECL发光液试剂盒检测蛋白的表达。使用30 μg蛋白进行ERK （1 ∶2 000） 和p-ERK （1 ∶1 000） 和β-actin抗体 （1 ∶2 000） 检测。MyD88、ERK和p-ERK的蛋白条带灰度值用Image J 软件进行分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠PMWT比较

结果显示，CCI手术前大鼠对Von Frey丝刺激产生缩腿反应的基线是13.6 g。与sham组比较，CCI组PMWT明显降低 （P＜ 0.01），并具有时间依赖性。与CCI组比较，治疗组PMWT术后1、3、5 d没有统计学差异 （P＞ 0.05），而术后7、14 d时明显升高 （P＜0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠PTWL比较

结果显示，CCI手术前大鼠对热刺激的缩腿反应基础阈值是 13 s。与sham组比较，CCI组PTWL明显缩短 （P＜ 0.01），并具有时间依赖性。与CCI组比较，治疗组PTWL明显增加 （P＜ 0.01）。说明鞘内注射蛇床子素能减弱CCI引起的热痛觉过敏。见表2。

表1 各组大鼠术后不同时间PMWT比较 （g）Tab.1 Comparison of PMWT in three rat groups after surgery （g）

表2 术后各组大鼠不同时间PTWL比较 （s）Tab.2 Comparison of PTWL in three rat groups after surgery （s）

2.3 各组大鼠DRG中MyD88、p-ERK的表达

结果显示，术后14 d sham组大鼠DRG中的MyD88、p-ERK表达很低。与sham组比较，CCI组DRG中MyD88、p-ERK表达明显增加 （P＜ 0.05）。与CCI组比较，治疗组术后14dDRG中MyD88、p-ERK蛋白表达明显减少 （P＜ 0.05），3组大鼠DRG中ERK 的表达没有统计学差异 （P＞ 0.05），见图1、表3。

图1 各组大鼠DRG中MyD88、p-ERK表达比较Fig.1 MyD88 and p-ERK expression in the DRG in each group

表3 各组大鼠DRG中MyD88、p-ERK的表达比较Tab.3 Comparison of MyD88 and p-ERK expression in three groups

3 讨论

神经病理性疼痛具有自发性、痛觉过敏与超敏特征，目前有针对性的治疗靶点仍未找到。CCI大鼠模型能够激活MyD88依赖性信号通路，引起下游蛋白表达变化［5］。研究［6-7］证明通过硬膜外注射蛇床子素能抑制髓核致痛大鼠DRG中COX-2的表达。易智华等［8］研究发现，蛇床子素能通过下调DRG神经元中P2X3R表达，减轻HIVgp120诱发的周围神经病理性疼痛。有研究［9］表明，蛇床子素通过抑制大鼠脊髓背角p38 MAPK信号相关通路，缓解髓核致炎症神经根痛 。还有研究［10］发现蛇床子素抑制大鼠DRG中CGRPR1蛋白的表达，缓解髓核致坐骨神经痛。

本研究结果显示蛇床子素抑制CCI大鼠DRG中MyD88和p-ERK的表达，可能机制是先通过抑制MyD88活化，影响下游信号通路ERK的磷酸化，进而缓解CCI引起的机械痛和热痛觉过敏。CCI大鼠模型会升高DRG中MyD88和p-ERK的表达，导致大鼠后足对机械痛和热痛过敏［5］。蛇床子素通过干预MyD88和p-ERK的信号通路，缓解了大鼠后足对机械痛与热痛过敏的情况。

蛇床子素具有多种药理作用，而且毒性小，可以抑制NG08-15神经元细胞的L型钙离子电流内流［11］。YANG等［12］研究发现，蛇床子素能够通过抑制小鼠DRG神经元对组胺和辣椒素的反应，进而减轻小鼠的瘙痒和疼痛。本研究为蛇床子素缓解疼痛的分子机制进行了必要的补充，为更好开发蛇床子素的临床镇痛应用提供有力证据。

综上所述，蛇床子素可下调CCI大鼠DRG中MyD88、p-ERK的表达，减轻神经病理性疼痛。本研究为神经病理性疼痛治疗提供了一个可能的作用靶点。