麝香通心滴丸对高血压大鼠血管内皮功能及Rho/ROCK信号通路的影响

李立杰，葛华 ，陈曦，鲁伟，王月，陈克研

（1.沈阳医学院附属中心医院心内科，沈阳 110024；2.中国医科大学实验动物部，沈阳 110122）

内皮细胞主要以旁分泌的形式分泌血管内皮衍生舒张因子 （endothelium derived relaxing factor，EDRF） 和内皮源血管收缩因子 （endothelium derived contracting factor，EDCF），两者共同调节血管张力。正常情况下，EDRF与EDCF处于平衡状态，但是在高血压病理情况下，血管压力增加，打破了EDRF与EDCF的平衡，造成内皮细胞形态结构改变和功能的失调，加速高血压的发生与发展，因此，血管内皮损伤既是高血压的病理结果，也是高血压的致病因素［1-2］。近年来减轻血管内皮损伤，改善血管内皮功能已经成为治疗高血压的研究热点［3］。麝香通心滴丸是目前国内应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病） 治疗的中药复方药物，由麝香、人参、茎叶总皂苷、蟾酥、丹参、熊胆粉、人工牛黄及冰片组成，具有芳香益气通脉，活血化瘀止痛之效［4-5］。临床研究［6］表明，麝香通心滴丸具有保护血管内皮作用，但具体分子机制尚不明确。

RhoA/ROCK信号通路是心血管系统领域的热点通路，RhoA GTP酶及其下游ROCK与血管平滑肌收缩、应力纤维形成、细胞迁移及血压调节等过程有关［7］。因此，RhoA/ROCK信号通路对高血压、动脉粥样硬化及中风等心血管系统疾病具有重要的调节作用。本研究建立高血压大鼠模型，给予麝香通心滴丸干预治疗，探讨麝香通心滴丸对高血压大鼠血管内皮的作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雄性自发性高血压大鼠20只及同类正常血压大鼠10只，体质量200～220 g，购自上海高血压病研究所实验动物中心。大鼠分笼饲养，室温20～25 ℃，湿度50%，每天光照12 h。适应性饲养1周后，采用随机数字表法将自发性高血压大鼠分为模型组 （SHR组） 及麝香通心滴丸组 （STX组），每组10只；正常血压大鼠作为对照组。

1.2 麝香通心滴丸剂量和配制方法

根据人体与动物药物等效剂量换算公式［8］：B种动物的剂量 （g）=A种动物剂量 （g/kg）×W （折算系数）×B种动物的体质量 （kg）。人与大鼠的折算系数为6。因此，麝香通心滴丸的大鼠给药剂量约为4.2 mg/kg，将麝香通心滴丸利用无菌蒸馏水配制成420 mg/mL药液，灌胃给药，1次/d，连续治疗2周，每周测量1次体质量，并根据体质量变化调整给药剂量，对照组和SHR组给予等体积蒸馏水。

1.3 大鼠收缩压测定

分别于给药前，给药1周、2周后，进行大鼠尾动脉血压测量，在恒温安静的环境下，上午8：00至12：00进行大鼠动脉血压测量，每次每只大鼠重复测量3次，血压以波动不超过10 mmHg为宜，取3次平均值。

1.4 动物处死及取材

给药2周后大鼠禁食12 h，然后戊巴比妥钠（50 mg/kg） 腹腔注射麻醉，于腹主动脉采血8 mL，10 000 r/min离心10 min分离血清，-20 ℃冰箱中保存备用。4%多聚甲醛灌注血管，随后生理盐水冲洗5 min，暴露胸主动脉，每只大鼠取胸主动脉 （约4.0 cm），液氮冷冻后置于-80 ℃深冻冰箱保存。

1.5 血管组织一氧化氮（nitric oxide，NO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide diasmutase，SOD）活性测定

分别采用硝酸还原酶法测定各组大鼠血管内皮NO含量、TBA法测定大鼠血管内皮MDA含量、采用羟胺法测定大鼠血管内皮SOD活性 （南京建成生物技术有限公司）。将各组大鼠胸主动脉，用1 mL预冷的PBS缓冲液匀浆，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，吸取上清液至新的离心管中，采用考马斯亮蓝检测组织匀浆液中蛋白含量。大鼠胸主动脉NO、MDA含量及SOD活性检测实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 大鼠血清中内皮素-1（endothelin-1，ET-1）及血管内皮生长因子（vascular endothelil growth factor，VEGF）含量测定

酶联免疫吸附实验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 检测各组大鼠血清中ET-1及VEGF含量，步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。酶标仪在450 nm波长下检测吸光度值，根据梯度浓度标准品的OD值绘制标准曲线，得到回归方程，根据回归方程计算样品中ET-1及VEGF含量。

1.7 血管组织 ET-1及VEGF mRNA表达测定

利用TRIzol法提取组织中总RNA，取各组大鼠胸主动脉加入1 mL TRIzol进行匀浆，匀浆液置于1.5 mL 离心管中备用；每管加入0.2 mL 氯仿，盖紧盖子后剧烈震摇15 s，冰浴5 min。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；取上层水相，加入0.5 mL 异丙醇，轻轻颠倒，冰浴10 min。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1 mL用DEPC处理的水配置的75%乙醇，洗涤沉淀。4 ℃ 7 500 r/min离心5 min；弃上清，自然吹干后用0.01% DEPC溶解沉淀，待用。按照试剂盒说明书合成cDNA。取2 μL cDNA为模板，按照实时 PCR说明书进行体外扩增，以β-actin作为内参，引物序列如下：β-actin，上游5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’，下游5’-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3’；ET-1，上游5’-AGGCGATCAGAGCAACCAG -3’，下游5’-CCA TCAAGGAGGAGCAGGA-3’；VEGF，上游5’-ACGTC GGAGAGCAACGTCAC-3’，下 游5’-ACCGGGATTTC TTGCGCTTTCGT-3’。结果使用2-△△Ct法计算基因相对表达变化。反应体系50 μL，反应条件如下：在95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环30次；72 ℃ 1 min。

1.8 Western blotting检测

将大鼠胸主动脉剪碎，提取总蛋白，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，使用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量，进行SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳，使用PVDF膜转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h，TBST洗膜，分别加入RhoA、ROCK、MLC及β-actin一抗（1 ∶1 000），TBST洗膜加入相应HRP标记二抗稀释浓度为1 ∶1 000，室温孵育1 h。TBST洗膜，ECL发光试剂盒发光，凝胶成像系统成像，Image J软件计算灰度值，采用目的条带与内参蛋白条带光密度比值作为结果。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 麝香通心滴丸对大鼠收缩压的影响

在给予麝香通心滴丸治疗前，SHR组及STX组大鼠收缩压与对照组比较明显升高，差异具有统计学意义 （P＜ 0.05），而SHR组与STX组大鼠收缩压差异没有统计学意义 （P＞ 0.05） ；在给药1周及2周后结果显示，与SHR组比较，STX组大鼠尾动脉收缩压明显降低，差异有统计学意义 （P＜ 0.05），见表1。

2.2 麝香通心滴丸对大鼠血管组织NO、MDA含量及SOD活性的影响

表1 各组大鼠不同时期收缩压比较 （mmHg）Tab.1 Changes in systolic blood pressure at different time points in each group （mmHg）

与对照组比较，SHR组大鼠血管组织中NO含量及SOD活性明显降低，而MDA含量却显著增加，差异有统计学意义 （均P＜ 0.05） ；给予麝香通心滴丸治疗后，与SHR组比较，STX组大鼠血管组织中NO含量及SOD活性明显增加，而MDA含量显著降低 （均P＜0.05），见表2。麝香通心滴丸能够明显增加高血压大鼠血管内皮NO含量并减轻氧化应激水平。

2.3 麝香通心滴丸对大鼠血清中ET-1及VEGF含量的影响

如表3所示，与对照组比较，SHR组大鼠血清中ET-1及VEGF含量明显升高 （P＜ 0.05） ；给予麝香通心滴丸治疗后，与SHR组比较，STX组大鼠血清中ET-1及VEGF含量显著降低 （P＜ 0.05）。麝香通心滴丸能够调节高血压大鼠体内血管活性物质的水平。

表2 各组大鼠血管组织中NO、MDA含量及SOD活性比较Tab.2 Comparison of NO，MDA content，and SOD activity in the vascular tissues of rats in each group

表3 各组大鼠血清中ET-1、VEGF含量及血管组织中ET-1、VEGF mRNA表达比较Tab.3 Comparison of ET-1 and VEGF levels in serum，as well as those of ET-1 and VEGF mRNA expression in the vascular tissues of rats in each group

2.4 麝香通心滴丸对大鼠血管组织中ET-1及VEGF mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠血管组织中ET-1及VEGFmRNA明显升高 （P＜ 0.05） ；给予麝香通心滴丸治疗后，与SHR组比较，大鼠血管组织中ET-1及VEGFmRNA显著降低 （均P＜ 0.05），见表3，与血清ELISA结果一致。

2.5 麝香通心滴丸对大鼠血管组织RhoA/ROCK信号通路的影响

结果显示，与对照组比较，SHR组大鼠RhoA、ROCK及MLC蛋白表达量明显升高 （均P＜ 0.05） ；给予麝香通心滴丸治疗后，与SHR组比较，STX组大鼠血管组织中RhoA、ROCK及MLC蛋白表达明显降低 （均P＜ 0.05），见图1、表4。麝香通心滴丸发挥对高血压大鼠血管内皮的保护作用，可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。

图1 各组大鼠RhoA、ROCK及MLC蛋白表达Fig.1 RhoA，ROCK，and MLC protein expression in each group

3 讨论

血管内皮细胞是循环血液与血管内皮组织之间的单层细胞，是机体血液与组织之间的代谢交换屏障，也是机体分泌多种活性物质的内分泌腺，具有调节血管收缩及舒张的能力。血管内皮是调节血管张力、细胞生长以及白细胞、血小板和血管壁之间相互作用的组织，血管内皮功能不良与高血压的发生发展密切相关［9］。内皮功能障碍可增加全身血管阻力，从而导致高血压的发展［10］。中医药治疗血管性病变主要以活血化瘀为主，降脂、抗凝，从而起到调节血管内皮功能的作用。麝香通心滴丸主要成分麝香具有抗血栓、抗血小板聚集的作用，并能抑制心肌耗氧量，对冠心病患者的血管内皮具有一定的保护作用；人参主要成分人参皂苷具有较强的抗氧化作用，对心肌缺血再灌注损伤、肝损伤及高血压、高血脂等大鼠模型均能够发挥清除氧自由基、抑制氧化应激的作用；蟾酥具有调节血压、扩张冠状动脉作用，同时还能够抑制炎症、调节免疫；丹参及熊胆粉具有降脂溶栓的作用［11-12］。因此，麝香通心滴丸能够多方面纠正血管内皮功能紊乱，保护血管内皮功能。

表4 各组大鼠RhoA、ROCK及MLC蛋白表达比较Tab.4 Comparison of RhoA，ROCK，and MLC protein expression in rats in each group

NO在心血管系统疾病发病机制及治疗中具有重要作用，NO能抑制血小板的聚集，防止血栓形成，抑制炎症浸润，增强免疫调节，降低血压和调节血管张力［13］。NO通过激活鸟苷酸环化酶以增加环磷酸鸟苷水平，环磷酸鸟苷能减少大量钙依赖性细胞内钙的含量，从而抑制钙介导的磷酸化，达到扩张血管目的。NO还能够通过调节血管张力抑制血管紧张素Ⅱ对近曲小管Na+的重吸收，影响胞内环磷酸腺苷对肾脏水钠盐滤过、重吸收，从而调节血压［14］。在病理状态下，NO释放受到抑制，造成血管舒张功能障碍或血管内皮收缩因子生成增加，导致血压升高，血压升高加重对内皮细胞的损害，进一步抑制NO的释放，造成恶性循环［15］。本研究STX组给予麝香通心滴丸后大鼠体内NO水平明显增加，说明其具有逆转高血压造成的NO合成及释放量降低的作用。

ET-1是由血管内皮分泌的细胞因子，具有强烈的缩血管作用。ET-1与NO是相互制约的血管活性物质，NO水平降低，ET-1水平则会增加，造成血管收缩。ET-1还能够通过激活钙通道，增加钙内流，促进血管平滑肌收缩和增生，增加外周血管阻力，引起血压升高［16］。VEGF是重要的促进血管生成的细胞因子。有研究［17］表明，高血压发生后VEGF表达升高，进而抑制血管内皮细胞凋亡促进增殖，导致血管通透性增加，可能与激活PI3K/AKT信号通路有关。本研究发现麝香通心滴丸治疗后，大鼠血清中ET-1及VEGF含量及胸主动脉ET-1及VEGFmRNA的表达明显降低，发挥了对高血压大鼠血管内皮的保护作用。

研究［18］显示高血压可导致机体SOD活性降低及MDA含量增加，从而发生氧化应激反应，导致血管内皮细胞功能受损。本研究中，高血压大鼠血管内皮中SOD活性明显降低，而MDA含量明显增加（均P＜ 0.05） ；麝香通心滴丸治疗能够增加SOD活性，降低MDA含量，改善高血压大鼠氧化应激水平，从而改善血管内皮损伤。

有研究［6，19］表明，RhoA/ROCK信号通路参与高血压的发生与发展，在不同高血压大鼠模型血管内皮中均可以检测出RhoA、ROCK的大量激活。给予ROCK抑制剂可不同程度降低血压，因此推测RhoA/ROCK信号通路有可能成为高血压治疗的有效靶点［20］。RhoA是Rho GTP酶家族中研究最广泛的成员之一，RhoA介导应力纤维的形成。ROCK为Rho激酶，是RhoA最直接的下游靶基因，具有调节细胞收缩、迁移和增殖等多种功能。血管内皮收缩与舒张的平衡对于维持血压稳定至关重要，RhoA/ROCK信号通路可以诱导机体对钙离子的敏感性增加，抑制MLC蛋白活性导致血管内皮收缩；同时，RhoA/ROCK信号通路激活后还能够促进MLC磷酸化，诱导血管内皮收缩，使血压升高［21-22］。本研究结果发现，麝香通心滴丸可以抑制高血压大鼠血管组织中RhoA、ROCK及MLC蛋白的表达，从而抑制RhoA/ROCK信号通路活性，抑制血管收缩，降低血管通透性，改善高血压大鼠血管内皮损伤。

综上所述，麝香通心滴丸能够增加高血压大鼠NO合成及释放，抑制血管活性物质ET-1及VEGF的含量，改善氧化应激，发挥降压和保护血管内皮的作用，其机制可能与抑制RhoA/ROCK信号通路有关。