脉冲射频通过调控Nrf2的表达减轻神经病理性疼痛大鼠的机械痛敏

樊修元，陶学恕，奚奇，王品莹，宋涛

（中国医科大学附属第一医院疼痛科，沈阳 110001）

神经病理性疼痛 （neuropathic pain，NP）［1］是由周围或神经系统的损伤和疾病所引起的疼痛，临床表现为自发痛、痛觉过敏、痛觉超敏和感觉异常。NP是临床疼痛中最常见的类型之一，发病率高，病理机制复杂，治疗困难。目前治疗NP的主要方法包括药物、神经阻滞、神经调控［包括脉冲射频 （pulse radiofrequency，PRF） 及脊髓电刺激术］、手术干预等［2-3］。PRF是一种非神经毁损性的射频技术［4］。PRF具有作用显著、创伤小、并发症少等优势，近年来已成为临床上治疗NP的主流手段。但是，目前PRF的作用机制尚未明确。

研究［5］显示，氧化应激反应在中枢敏化中发挥着重要作用。许多神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病等的病因与氧化应激及损伤有关。氧化应激反应也同时参与外周神经损伤引起的NP。核因子E2相关因子2 （nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2） 是Cap-n-Collar家族的成员。其结构中的亮氨酸拉链结构域Neh1能与抗氧化效应元件绑定，调控多种抗氧化酶的表达，作为机体自身天然的抗氧化防御体系，对抗机体中过多自由基的损害，发挥自身防御和修复的作用［6］。

本研究采用大鼠坐骨神经分支损伤（spared nerve injury，SNI） 模型，观察PRF治疗后SNI大鼠疼痛行为学的改变及脊髓中Nrf2表达的变化，探讨PRF可能的镇痛机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠24只，体质量180～220 g，由辽宁长生生物公司提供，分笼饲养于22～24 ℃、12 h明暗交替的环境中，自由取食。本动物实验经中国医科大学实验动物伦理委员会批准 （IACUC no.2019091）。

1.1.2 主要试剂及仪器：Nrf2 （英国Abcam公司），GAPDH内参抗体 （美国Proteintech公司），SDS-PAGE快速凝胶试剂盒 （江苏凯基生物技术公司），BCA蛋白浓度检测试剂盒 （杭州弗德生物技术公司），RIPA裂解液 （美国Beyotime生物技术研究所），蛋白酶抑制剂 （美国Roche公司）。射频控温热凝器 （R-2000B A1，美国北琪公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SNI疼痛模型建立：参照DECOSTERD等［7］的方法建立大鼠SNI疼痛模型。3%异氟烷麻醉大鼠，取右后肢建立SNI模型，所有手术操作均在无菌条件下进行。

1.2.2 大鼠疼痛行为学测定：参照文献［8］进行大鼠机械痛阈的检测。将大鼠置于网状底部的笼子中，将校准的纤毛Von Frey细丝垂直作用于后爪，直到观察到阳性反应 （缩回、舔或摇动爪子） 为止。使用“up and down”方法确定大鼠机械缩足阈值 （paw withdrawal threshold，PWT）。运用公式对测得的痛阈值进行校正。

1.2.3 Western blotting：用于测定样品中Nrf2蛋白表达情况。大鼠经5%七氟烷麻醉处死，快速断头，在冰浴中快速取出右侧L4～6脊髓，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液400 μL匀浆，0 ℃孵育30 min后，4℃、12 000 r/min离心10 min。收集上清液，蛋白定量，上样行SDS-PAGE凝胶电泳，100 V、90 min转至PVDF膜。在室温下，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，加一抗［兔抗大鼠 Nrf2 （1︰1 000）、GAPDH （兔源1︰2 000）］，4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL显影曝光 （Image Lab凝胶成像分析仪处理系统成像）。Nrf2蛋白与内参的灰度比值表示Nrf2蛋白的相对表达量。

1.2.4 大鼠分组： （1） 按照随机分组的原则，将18只大鼠随机分为正常组和SNI模型组，正常组不做任何处理，根据术后的时间再将SNI模型组分为1 d、3 d、7 d、10 d、14 d组，每组3只。检测各组大鼠PWT。分别于术后1 d、3 d、7 d、10 d、14 d处死相应SNI组大鼠，正常组与SNI14 d组一同处死。测量大鼠脊髓中Nrf2的表达情况。（2） 为了研究PRF治疗对SNI大鼠脊髓Nrf2表达的影响，另取9只SD大鼠，随机分为假手术组 （暴露SD大鼠的坐骨神经，放置无脉冲的射频针5 min后，逐层缝合）、SNI组和PRF组 （SNI建模14 d后再次暴露大鼠右侧坐骨神经，在坐骨神经损伤处行PRF治疗，PRF参数设为20 ms、2 Hz、45 V，温度不高于42 ℃，5 min后逐层缝合），每组3只。在PRF治疗后第9天处死各组大鼠，检测各组大鼠脊髓中Nrf2的表达情况。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 NP对大鼠PWT的影响

SNI模型建立后，与正常组相比，SNI模型组PWT显著降低，提示NP可降低大鼠的PWT。见表1。

2.2 NP对大鼠脊髓背角中Nrf2表达的影响

Western blotting结果显示，SNI1 d组大鼠脊髓背角中Nrf2蛋白表达水平 （0.28±0.06） 最高，其后随时间推移逐渐减少 （SNI3 d组：0.19±0.03；SNI7 d组：0.13±0.02；SNI10 d组：0.12±0.02；SNI14 d组：0.05±0.00），差异有统计学意义。见图1。

2.3 PRF治疗对NP大鼠PWT的影响

治疗前各组大鼠的PWT比较，差异无统计学意义 （P＞ 0.05）。PRF组大鼠从治疗后第1天开始PWT逐渐升高；PRF组治疗后第9天，PWT显著高于SNI组，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。见表2。

2.4 PRF治疗对NP大鼠脊髓中Nrf2表达的影响

PRF治疗后第9天，对各组大鼠脊髓中Nrf2的表达水平进行比较，结果发现，PRF组Nrf2的表达水平（0.43±0.04） 较SNI组 （0.29±0.02） 明显升高，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。假手术组Nrf2的表达量（0.70±0.04） 较SNI组、PRF组明显升高，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。见图2。

表1 SNI模型组与正常组大鼠机械刺激缩足反应阈值的比较 （，g）Tab.1 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in each group （，g）

表1 SNI模型组与正常组大鼠机械刺激缩足反应阈值的比较 （，g）Tab.1 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in each group （，g）

NC，normal control；SNI，spared nerve injury.

图1 SNI模型组大鼠脊髓中Nrf2蛋白的表达Fig.1 Expression of Nrf2 protein in spinal dorsal horn of rats in SNI group

3 讨论

研究［9］显示，SNI模型大鼠的行为学表现与人类NP相似。KIASALARI等［10］发现，氧化应激反应可促进NP的发生。而Nrf2是抗氧化反应的主要调节剂，可以减轻NP［6，11］。Nrf2基因敲除鼠因发生肾小球肾炎等炎症，死亡率高于正常鼠，提示Nrf2在炎症反应的发生发展中起着重要作用［12］。

PRF以其独特的优势成为治疗慢性疼痛的重要的微创镇痛技术。该技术利用高能量脉冲式电流，刺激靶向神经组织，通过干扰神经信号通路及可逆性抑制神经元突触，发挥镇痛作用，且镇痛作用确切［13-18］，但其机制尚不明确。本研究发现，SNI大鼠PWT在神经损伤后第1天显著下降，并随时间的推移逐渐下降，在SNI14 d时维持在较低的水平。进行PRF治疗后，与SNI组相比，PRF组大鼠PWT明显上调，且在PRF治疗后第9天2组出现统计学差异 （P＜0.05）。提示PRF能够提高SNI大鼠的机械痛域，发挥镇痛作用。分子水平上，SNI模型大鼠脊髓中Nrf2的表达水平在损伤后第1天略有增加，而后开始逐渐减少。提示Nrf2可能在NP早期发挥保护作用。PRF治疗后第9天，与SNI组相比，PRF组大鼠脊髓中Nrf2表达水平明显升高，差异有统计学意义 （P＜ 0.05）。提示PRF治疗可增加SNI大鼠脊髓中Nrf2的表达水平，Nrf2可能在减轻外周神经损伤大鼠的疼痛中发挥一定作用。由此推测PRF治疗可影响SNI大鼠脊髓中抗氧化物的表达，从而发挥镇痛作用。

表2 SNI组、假手术组、PRF组大鼠机械刺激缩足反应阈值的比较 （，g）Tab.2 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in SNI，sham，and PRF groups （，g）

表2 SNI组、假手术组、PRF组大鼠机械刺激缩足反应阈值的比较 （，g）Tab.2 Comparison of PWT mechanical stimulation of rats in SNI，sham，and PRF groups （，g）

1） P ＜ 0.05 vs SNI group.

综上所述，PRF治疗可提高SNI大鼠模型的PWT，并使其脊髓中Nrf2表达上调，其具体机制有待进一步研究证实。

图2 3组大鼠脊髓中Nrf2蛋白的表达Fig.2 Expression of Nrf2 protein in rats’spinal dorsal horn among 3 groups