温度和pH变化对旋链角毛藻生长及释放二甲基硫化物的影响❋

于海潮，张洪海,2,3，高旭旭，杨桂朋,2,3❋❋

(1.中国海洋大学化学化工学院，山东 青岛 266100；2.海洋国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室，山东 青岛 266237；3.中国海洋大学海洋化学研究所，山东 青岛 266100)

自工业革命以来，人类工业迅速发展，对化石能源的大量使用使大气中CO2浓度从工业革命前的0.028 kPa增加至0.04 kPa[1]。CO2作为重要温室气体，能大量吸收地面反射的红外线，引起全球温度的升高。作为大气CO2最大的汇之一，目前海水表层pH已降低了0.1个单位，并有继续降低的趋势[2]。全球变暖和海洋酸化问题日益严重。而在海洋生态系统中，浮游植物贡献了绝大部分初级生产力，为全球的物质循环和能量流动提供了基础，其生长繁殖既受气候影响，又对全球气候调节有着重要作用[3-4]。全球变暖和海洋酸化将导致浮游植物生存环境的改变，其影响不容忽视。

二甲巯基丙酸内盐(DMSP)是DMS的主要前体物质，一般以颗粒态(Particulate DMSP,DMSPp)和溶解态(Dissolved DMSP,DMSPd)两种形式存在，主要来自海洋浮游植物的释放[12]。DMSP是海洋中DMS的主要来源，可以在浮游植物细胞内经裂解酶产生DMS，或在释放到海水中之后在细菌等微生物的作用下产生DMS。DMSP有调节藻类细胞内渗透压的作用，对环境相对敏感，受盐度、温度、光照、营养盐等多种因素影响[13]。DMSP的浓度分布及转化情况对DMS有着直接影响，进而影响着全球气候变化。

早期的海洋酸化研究中，对象主要集中在钙化藻类，如大洋桥石藻(Gephyrocapsaoceanica)和赫氏圆石藻(Emilianiahuxleyi)[14]，颗石藻(Emiliania.huxleyi)[15]等。随着对海洋酸化的进一步研究，硅藻作为浮游植物的重要组成逐渐受到重视。本文选择的旋链角毛藻隶属于角毛藻属，是一种小型的海洋浮游硅藻，细胞小而壁薄，多为单个生活，广泛分布于我国东海、黄海、渤海等区域，是胶州湾夏季的主要优势藻种，曾多次引发赤潮[16]。目前国内对旋链角毛藻的研究较为有限，多集中于温度、光照等单因素影响下的生长情况变化[17]，及对自然环境下旋链角毛藻的二甲基硫化物释放量进行研究[18]等。因此本文选择在pH和温度两种实验条件下同时检测旋链角毛藻生物量的变化情况和二甲基硫化物的释放情况，通过研究不同pH和不同温度的交互影响下旋链角毛藻的生物量及释放二甲基硫化物的变化，为进一步解释全球气候变暖、海洋酸化对旋链角毛藻的生长及释放二甲基硫化物的影响提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 藻类培养

实验所用旋链角毛藻取自中国海洋大学海洋污染生态化学实验室微藻培养室。实验用海水采用中国东海海水，经0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤，121 ℃灭菌20 min后使用。

实验使用500 mL胶塞封口瓶进行无顶空、半连续培养，培养液采用f/2营养配方(所有成分均经过高温灭菌处理)。按培养液体积1∶20的比例定量接入指数生长期的旋链角毛藻后，将封口瓶置于光照培养箱(光暗周期12 h∶12 h，光照强度4 000 lx，光源为白色冷荧光灯管)中连续培养。

培养期间需每天3次震荡样品瓶，以防藻类沉淀，保证藻类生长状态良好及溶解气体保持稳定。每隔一天上午9:00进行取样，取样后加饱和CO2培养液调节pH至设定值，然后补充相应pH的适量培养液以保持无顶空状态。

1.2 实验设置

根据茅华等[17]的研究结果，旋链角毛藻的最佳生长环境是：温度为20 ℃，pH为8.1。结合全球变暖情况及全球海洋环境变化趋势[19-20]，本文设定了较高温度和较低pH值环境与旋链角毛藻最佳生长环境相比较，分别设定：2个温度(20、25 ℃)和2个pH(7.8、8.1)。每组实验设定3个平行样。前期培养旋链角毛藻藻种至指数生长期后接入样品瓶，连续培养16天，期间保持pH稳定(±0.08)的无顶空状态。培养期间隔天取样，分别测定旋链角毛藻的生物量、培养液中DMS、DMSP总量(DMSPt)和DMSPd含量。使用SPSS 19.0软件进行数据处理，单因素方差分析(One-way ANOVA)进行显著性分析。

1.3 样品分析方法

1.3.1 藻细胞密度和比生长率的测定 取4 mL藻液，加入鲁格试剂将藻细胞进行固定，用血球计数板在光学显微镜下进行计数。每个样品计数三次，取其平均值。藻密度计算公式为：

X=A/4×10 000。

(1)

式中:X为藻密度，单位为cell·mL-1；A为显微镜下所计数量平均值。

比生长率计算公式为：

μ=(lnCn-lnC0)/(Tn-T0)。

(2)

式中:μ代表比生长率；Cn、C0分别代表第n天、第0天的细胞密度；Tn、T0分别代表培养第n天、第0天。

1.3.2 培养液中DMS的测定 采用冷阱吹扫-捕集气相色谱法进行DMS样品测定[21-22]。用5 mL玻璃注射器精确取得2 mL海水样品于干燥的10 mL西林瓶中，用高纯N2吹扫样品，使样品中的DMS通过Nafion管除水。干燥后的气体经六通阀进入1/16 Teflon捕集管，对DMS进行富集浓缩，吹扫3 min后，将捕集管迅速放入热水(90 ℃)中进行解析，DMS随载气进入气相色谱仪(岛津GC-2014)，由火焰光度检测器(FPD)进行检测。使用本方法测定的DMS检出限为0.2 nmol·L-1，相对标准偏差(RSD)小于5%[23]。

1.3.3 培养液中DMSP的测定 由于在强碱(pH≥ 13)条件下，DMSP可以1∶1完全降解为DMS[24]，所以往往测定DMS间接获得DMSP的含量，另外，用DMSPt减去DMSPd的浓度即可得DMSPp的浓度。DMSPt测定过程为：取4 mL培养液，加入40 μL 的50%H2SO4溶液去除培养液中的DMS，然后从中取2 mL培养液样品，加入200 μL的10 mol·L-1KOH溶液，密封后在4 ℃条件下避光静置大于24 h以确保DMSP能够完全转化为DMS。DMSPd测定时需先用Whatman GF/F 玻璃纤维滤膜进行重力过滤，取4 mL滤液，其他过程同上。24 h后按照DMS分析方法进行测量，得到的即为DMSP的含量[25]。

2 实验结果

2.1 不同pH、温度下旋链角毛藻藻密度的变化情况

4组实验条件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋链角毛藻的藻细胞密度变化如图1所示。四种条件下的旋链角毛藻生长趋势都基本呈现S型曲线，符合藻类一次性培养的生长规律。

图1 培养液中旋链角毛藻藻密度变化Fig.1 Changes in the density of Chaetoceros curvisetusin the culture

pH=7.8时，20 ℃条件下旋链角毛藻在培养第1～7天迅速生长，在第7天达到峰值(19.675×105cell·mL-1)，第9～16天基本保持稳定生长；25 ℃条件下旋链角毛藻在培养第3～9天迅速生长，在第9天达到峰值(16.15×105cell·mL-1)，第11～16天进入衰亡期，藻细胞数略有下降。pH=8.1时，20 ℃、25 ℃条件下的旋链角毛藻生长趋势基本同上，20 ℃时在第7天达到峰值(21.3×105cell·mL-1)，25 ℃在第9天达到峰值(16.8×105cell·mL-1)。

温度为20 ℃时，两种pH条件下的旋链角毛藻生长趋势基本一致，都是在第1～7天迅速生长，第7～9天略有下降，第9～16天基本保持稳定。其中，pH为8.1时藻密度要略大于pH为7.8时。温度为25 ℃时，两种pH条件下的旋链角毛藻生长趋势也基本保持一致，峰值均出现在第9天时。其中，pH为7.8时前期藻密度较大，但在第9天达到峰值时，pH为8.1时藻密度略大于pH为7.8时，整体差异不大。

2.2 不同pH、温度下旋链角毛藻比生长率的变化情况

4组实验条件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋链角毛藻比生长率变化如图2所示。四种条件下的比生长率分别在第3、5、5和5 d达到最大值，分别为0.59、0.50、0.50和0.41 d-1。4组曲线整体上均呈现先快速增长后缓慢降低的趋势。

20 ℃条件下，pH=7.8时比生长率在第1～3天快速增长，并在第3～7天保持较高值，pH=8.1时比生长率在第1～5天快速增长，并在第5～7天保持较高值；25 ℃条件下，pH=7.8时比生长率在第1～3天几乎无变化，在第3～5天快速增长至峰值，pH=8.1时比生长率在第1～5天逐渐增长，并在第5～7天保持相对稳定。四种条件下的比生长率在第7～16天期间均呈逐渐减小的趋势，数值上差异不大。

图2 培养液中旋链角毛藻比生长率变化Fig.2 Changes in specific growth rate of Chaetoceros curvisetusin the culture

2.3 不同pH、温度下旋链角毛藻单细胞释放DMS的变化情况

4组实验条件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋链角毛藻培养过程中单细胞DMS浓度变化如图3所示。单细胞DMS浓度变化范围分别为(0.92～45.36)(13.96)×10-9，(2.10～27.12)(9.27)×10-9，(1.91～19.62)(14.32)×10-9，(1.45～34.57)(11.07)×10-9nmol·cell-1。在不同pH、温度条件下，单细胞DMS浓度变化曲线基本一致，均符合先增大后减小的整体趋势。

图3 pH、温度变化对旋链角毛藻单细胞DMS含量的影响Fig.3 Effects of pH and temperature on DMS content in single cell of Chaetoceros curvisetus

温度为20 ℃时，两种pH条件下DMS浓度变化趋势基本一致：第1～7天小范围浮动，第7～9天迅速增长至最大值，第9～16天逐渐减少；其中，pH为8.1时DMS浓度略大于pH为7.8时。温度为25 ℃时，两种pH条件下DMS浓度变化趋势基本一致：第1～7天基本保持稳定，浓度变化很小，第7～11天迅速增长至最大值，第11～16天逐渐减少；前期两种pH条件下DMS浓度基本相同，第7天之后pH为8.1时DMS浓度略大于pH为7.8时。

如图3所示，温度从20 ℃升高到25 ℃时，DMS浓度峰值的出现从第9天推移到第11天，最大值也从47.41 nmol·cell-1(pH=7.8)和54.83 nmol·cell-1(pH=8.1)，下降到27.94 nmol·cell-1(pH=7.8)和39.50 nmol·cell-1(pH=8.1)。而温度不变时，改变pH，DMS浓度的整体变化趋势基本不变，数值随pH降低而略有减小。

2.4 不同pH、温度下旋链角毛藻单细胞DMSP含量的变化情况

4组实验条件下(pH=7.8，20 ℃、pH=7.8，25 ℃、pH=8.1，20 ℃和pH=8.1，25 ℃)旋链角毛藻培养过程中单细胞DMSPt、DMSPd浓度变化分别如图4和图5所示。其中，单细胞DMSPt浓度变化范围分别为(1.18～52.00)(13.89)×10-8，(5.29～13.96)(9.88)×10-8，(2.87～62.94)(14.28)×10-8，(4.31～22.72)(9.99)×10-8nmol·cell-1。单细胞DMSPd浓度变化范围分别为(0.34～9.82)(2.86)×10-8，(0.81～3.20)(2.05)×10-8，(0.74～12.10)(3.31)×10-8，(2.29～14.76)(6.99)×10-8nmol·cell-1。

图4 pH、温度对旋链角毛藻单细胞DMSPt含量的影响Fig.4 Effects of pH and temperature on DMSPt content in single cell of Chaetoceros curvisetus

比较实验中，DMSPt、DMSPd的变化趋势高度一致，基本都符合先增加后减少的趋势：在第1～7天基本保持稳定，DMSP浓度小范围浮动，第7～9天迅速增长至最大值，第9～16天逐渐减少。峰值按pH=8.1，20 ℃、pH=7.8，20 ℃、pH=8.1，25 ℃、pH=7.8，25 ℃依次递减。

图5 pH、温度对旋链角毛藻单细胞DMSPd含量的影响Fig.5 Effects of pH and temperature on DMSPd content in single cell of Chaetoceros curvisetus

2.5 旋链角毛藻藻密度与释放DMSP总量

分别以20 ℃，pH=8.1；25 ℃，pH=7.8为例，分析旋链角毛藻藻密度变化与释放DMSP总量的关系，变化曲线如图6、7。

图6 20 ℃，pH=8.1时，旋链角毛藻藻密度与培养液中DMSP总浓度变化Fig.6 Changes in the density and the total concentration of DMSP in the culture of Chaetoceros curvisetus at 20 ℃ and pH=8.1

图7 25 ℃，pH=7.8时，旋链角毛藻藻密度与培养液中DMSP总浓度变化Fig.7 Changes in the density and the total concentration of DMSP in the culture of Chaetoceros curvisetus at 25 ℃ and pH=7.8

20 ℃，pH=8.1时，前期旋链角毛藻藻密度持续增长，DMSP总含量基本保持不变；第7～9天时藻密度下降，DMSP总浓度迅速增大至最大值；第9～16天藻密度变化小幅度波动，DMSP浓度在第11天时迅速减小，在第11～16天期间保持小范围的变化。25 ℃，pH=7.8时，DMSP浓度变化总体幅度较小，DMSP浓度与藻密度变化趋势基本与20 ℃，pH=8.1时保持一致，同样是在藻密度迅速下降时DMSP浓度猛增至峰值。25与20 ℃条件下，指数生长期中的藻密度与DMSP释放量均存在较明显变化(P<0.05)。

2.6 旋链角毛藻藻密度与释放DMS总量的比较

分别以20 ℃，pH=8.1；25 ℃，pH=7.8为例，分析旋链角毛藻藻密度变化与释放DMS总量的关系，变化曲线如图8、9。

图8 20 ℃，pH=8.1时，旋链角毛藻藻密度与培养液中DMS总浓度变化Fig.8 Changes in the density and the total concentration of DMS in the culture of Chaetoceros curvisetusat 20 ℃ and pH=8.1

图9 25 ℃，pH=7.8时，旋链角毛藻藻密度与培养液中DMS总浓度变化Fig.9 Changes in the density and the total concentration of DMS in the culture of Chaetoceros curvisetusat 25℃ and pH=7.8

20 ℃，pH=8.1时，前期旋链角毛藻藻密度持续增长，DMS总含量无明显变化；第7～9天时藻密度下降，DMS总浓度迅速增大至最大值；第9～16天藻密度变化小幅度波动，DMS浓度也随之有小范围的变化。25 ℃，pH=7.8时，DMS浓度与藻密度变化趋势基本与20 ℃，pH=8.1时保持一致，不同的是藻密度峰值延迟至第9天出现，而DMS浓度的峰值也随之延迟到了第11天，同样是在藻密度迅速下降时DMS浓度猛增至峰值。不同温度条件下，指数生长期中的藻密度与DMS释放量均存在较明显变化(P<0.05)。

3 分析与讨论

pH、温度变化实验结果表明，旋链角毛藻较其他藻类而言对pH变化相对敏感，藻密度和生长比率均随pH降低而有所下降，但温度因素对旋链角毛藻生长的影响程度要远大于pH因素[26]。由旋链角毛藻藻密度变化曲线(见图1)可以看出旋链角毛藻在20～25 ℃，pH为7.8～8.1条件下均能存活，但pH=8.1，20 ℃条件下更适合于旋链角毛藻的生长，全球变暖、海洋酸化等问题带来的温度升高，pH降低等变化将会一定程度上抑制旋链角毛藻的生长。茅华等[17]通过对旋链角毛藻在不同温度、pH条件下培养研究得出的最佳生长条件：温度为20℃，光照为78.12 μE·m-2·s-1，盐度为25，pH为8.3。这与本文结果基本一致。

与此同时，在实验条件范围内，pH变化对旋链角毛藻释放DMS的量影响不大，温度变化却对旋链角毛藻释放DMS量有着重要影响。这与温度是旋链角毛藻生物量变化的重要影响因素相呼应，进一步证明了浮游植物是DMS的重要来源。目前国际上对于海洋酸化对二甲基硫化物的释放是否存在影响、存在着怎样的影响并没有得出统一的答案，如Vogt等[27]发现，低pH(CO2浓度为：(700～1 050)×10-6)和高pH(CO2浓度为：350×10-6)条件下，DMS和DMSPd浓度并没有显著差异。而Hopkins等[28]研究发现，低pH(CO2浓度为：750×10-6)与高pH(CO2浓度为：380×10-6)条件相比，DMS和DMSPd浓度显著降低。不同的结果可能是由于实验方法的差异，而本文得出的结论与Vogt等基本一致。本文所研究的旋链角毛藻虽然不是DMS高产藻种，但在如东海等海域作为优势藻种在数量上有着巨大优势，对DMS的释放依然有着不可忽视的重要作用。

培养液中的DMS由DMSP降解而产生，因此DMSP含量变化与DMS含量紧密相关。DMSP降解的主要途径有两种：一是在载体和酶的作用下，DMSP去甲基化生成甲硫醇和丙烯酸盐，二是在DMSP裂解酶作用下，DMSP裂解产生DMS和丙烯酸盐。其中，第二种途径是DMS的主要来源[29-30]。4组实验中，单细胞中DMS与DMSP的浓度变化趋势基本保持同步，但在25 ℃条件下，单细胞DMS含量的峰值较20℃时略有延迟；pH变化对二者变化趋势及峰值均无明显影响。由此表明，DMSP裂解产生DMS的过程主要受温度变化影响，在20～25 ℃范围内与温度呈负相关，而pH变化对DMSP裂解过程影响不大。

由图8和9可以看出，DMS浓度迅速增长均出现于藻密度迅速减小时，pH、温度的变化仅在一定程度上延迟了峰值的出现，但并未改变DMS峰值出现于藻类生长衰亡期这一相关关系。DMS虽然可以由浮游植物直接释放，但主要还是来源于DMSP的降解。浮游植物细胞生长期间可以自然分泌少量DMSP至培养液中，或在被浮游动物吞噬、病毒入侵或细胞自然衰老等情况下造成植物细胞破裂，大量DMSP直接进入培养液中，降解生成大量DMS[31～32]。因此在微藻培养实验中，DMS的峰值多出现在藻类生长的衰亡期[18,33]。

4 结论

(1)实验条件下20 ℃，pH=8.1时，旋链角毛藻生长情况最佳。温度升高对旋链角毛藻藻密度及比生长率都有着明显的抑制作用，相比之下，pH的影响较小。

(2)温度升高时DMS浓度明显降低，pH降低时DMS浓度略有减小，这与温度、pH对藻密度的影响情况相一致，说明温度升高抑制了藻密度的增长，进而减少了DMS的释放量。

(3)DMSPt和DMSPd的变化趋势高度一致，基本都符合先增加后减少的趋势。温度升高对DMSP浓度增加有着明显的抑制作用，而pH的影响较小。

(4)四组实验中DMS浓度的峰值均出现于藻类生长的衰亡期，表明旋链角毛藻衰亡期细胞破裂会导致大量DMSP进入培养液中，降解生成DMS。而藻细胞破裂释放DMSP过程并不受pH、温度变化的影响。