瑞舒伐他汀减轻脓毒症大鼠心肌损伤的机制研究

齐心欣，顾忠民，念其银

严重脓毒症常引起多器官功能衰竭，心脏为最常见的受累器官。目前脓毒症心肌损伤病死率高，但发病机制仍未完全明确[1]。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是一种新型亲水型他汀类药物，其药理作用较其他亲脂型他汀作用强且体内代谢途径广、副作用较低，尚有抗炎、抗氧化等功能，目前在心血管疾病尤其急性冠脉综合征、动脉粥样硬化等治疗中应用广泛[2]，但其是否可减轻脓毒症心肌损害目前鲜有报道。微小RNA-1(miR-1)是新近受关注的miR之一，是心肌细胞中表达丰度最高miRNA，对维持心肌细胞正常生理功能发挥着重要作用。新近研究发现，miR-1与急性心肌梗死、心力衰竭等有关，但关于miR-1在脓毒症心肌损害中的作用，目前未见报道[3]。故笔者通过实验比较脓毒症大鼠予瑞舒伐他汀治疗后，心肌miR-1、心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)、丙二醛(MDA)、Toll样受体4 mRNA(TLR4 mRNA)水平变化，探讨其减轻脓毒症心肌损伤的作用机制，相关研究可为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1动物及分组 30只6周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠，体重(200±20)g(上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK沪，2017-0005)，通过随机数字表法将大鼠分为三组，即假手术组(Sham组)、脓毒症组(CLP组)、脓毒症瑞舒伐他汀治疗组(ROS组)，每组10只。

1.2试剂及仪器 瑞舒伐他汀(阿斯利康制药有限公司，批号：135511)，大鼠H-FABP ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：20190902)，大鼠MDA ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：20190816)，mRNA逆转录试剂盒(北京康为世纪公司，批号：CW2569)，miRNA逆转录试剂盒(北京康为世纪公司，批号：CW2141)，Trizol RNA提取试剂盒(美国Thermo公司，批号：15596026)，引物(上海生物工程有限公司)，DM2000 Plus DNA Marker(北京康为世纪公司，批号：CW0632)，10%水合氯醛溶液(上海强顺化工有限公司)，10%甲醛溶液(西陇化工股份有限公司)，电动玻璃匀浆器(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：DY89-1)，离心机(河北省安新县白洋离心机厂，型号：BFX5-320)，台式冷冻离心机(德国eppendorf公司，型号：TGL-18R)，酶标仪(美国AWARENESS公司，型号：Stat Fax 2100)，荧光定量RCP仪(美国Thermo公司，型号：PIKOREAL96)，石蜡切片机(德国徕卡公司，型号：RM2235)，光学显微镜(日本Olympus公司，型号：BX51TF)等。

1.3方法

1.3.1给药方法 Sham组及CLP组于造模前，每日予淀粉(2.0 mg·kg-1·d-1)加入2 ml生理盐水制成混悬液灌胃，1次/d，连续5 d；ROS组于造模前，每日予瑞舒伐他汀(2.0 mg·kg-1·d-1，按成人20 mg/d给药及大鼠与人体的重量换算得出)加入2 ml生理盐水制成混悬液灌胃，1次/d，连续5 d。术前12 h禁食。

1.3.2模型制作 CLP组及ROS组通过盲肠结扎穿孔法[4]造模：大鼠给予10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，腹部手术切开进入腹腔，将盲肠中段丝线结扎，在扎线下0.5 cm处用25号针头贯穿肠壁1次，形成漏口2处，回纳盲肠并逐层缝合关腹。Sham组同法麻醉后开关腹，但不予盲肠结扎穿孔。三组术毕均皮下注射平衡液50 ml/kg抗休克治疗，术后正常饮食、饮水。

1.3.3标本采集 术后24 h各组大鼠经10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，摘眼球采血2 ml，3000 r/min离心20 min分离血清置-80℃冰箱保存待检H-FABP；快速取左心组织制成匀浆，3000 r/min离心20 min分离上清液置-80℃冰箱保存待检miR-1、TLR4 mRNA及MDA；快速取右心组织用10%甲醛溶液固定24 h。

1.3.4观察项目及检测方法

1.3.4.1H-FABP及MDA浓度测定 分离血清及组织匀浆标本按照ELISA试剂盒使用说明检测H-FABP及MDA浓度。

1.3.4.2TLR4 mRNA相对表达量测定 取保存20 mg心肌组织，根据Trizol RNA提取试剂盒提取组织RNA，利用紫外分光光度计在260 nm与280 nm处测定其吸光度并计算RNA浓度；按照逆转录试剂盒使用说明，配置 20 μl的总反应体系，逆转录合成cDNA；参考试剂盒说明书，配置30 μl反应体系，行RT-qPCR扩增，扩增条件：95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 30 s，共40个循环。TLR4 mRNA相对表达定量采用2-△△Ct计算。

1.3.4.3miR-1相对表达量测定 同法提取心肌组织RNA，紫外分光光度计测定并计算RNA浓度；按照逆转录试剂盒要求，配置20 μl的总反应体系，逆转录miRNA-1；参考试剂盒说明书，配置30 μl反应体系，行RT-qPCR扩增，扩增条件：95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 30 s，共40个循环。miR-1相对表达定量采用2-△△Ct计算。

1.3.4.4心肌病理学检查 取经10%甲醛固定的心肌组织，石蜡包埋常规切片，光学显微镜下比较各组大鼠心肌病理改变。

2 结 果

2.1各组大鼠H-FABP、MDA、TLR4 mRNA及miR-1浓度比较 见表1。三组术后24 h H-FABP、MDA、TLR4 mRNA及miR-1浓度间均有显著差异(P<0.01)；与Sham组比较，术后24 h CLP、ROS组H-FABP、MDA及TLR4 mRNA浓度均升高，miR-1浓度均下降(P<0.01)；与CLP组同期比较，ROS组H-FABP、MDA及TLR4 mRNA浓度均明显下降，miR-1浓度升高(P<0.01)。

2.2各组大鼠心肌组织变化比较 见封4(图1)。Sham组大鼠心肌组织排列一致、心肌细胞结构清晰、包膜完整、细胞间隙未见渗出性改变；CLP组可见心肌细胞排列紊乱、细胞肿胀、变性、细胞结构模糊、细胞间隙增宽，可见明显渗出；ROS组治疗后心肌细胞肿胀、坏死等病变有所减轻，细胞间质渗出有所减少。

表1 各组大鼠H-FABP、MDA、TLR4 mRNA及miR-1浓度比较

注：与Sham组比较，*P<0.01；与CLP组比较，#P<0.01，ΔP<0.05

3 讨 论

脓毒症心肌损害是严重脓毒症的常见并发症，其发病机制复杂，目前研究认为其与心肌炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、心肌抑制因子等多因素有关，但具体机制仍不详。新近研究提示他汀类药物具有抗炎、免疫调节、改善血管内皮等功能[3]，相关实验支持阿托伐他汀等脂溶性他汀类药物能减轻脓毒症相关炎症反应[5]。瑞舒伐他汀是一种新型亲水型他汀类药物，其药理作用较其他亲脂型他汀作用强且体内代谢途径广、副作用较低，但其对脓毒症心肌损害的影响目前鲜有报道，故本研究予重点观察。

H-FABP是心肌细胞特有的蛋白标志物，其作为脂肪酸运输载体参与了心肌细胞线粒体脂肪酸氧化代谢[6]。现有研究提示心肌缺血损伤后1～3 h，H-FABP血清水平即明显增高，其特异性及灵敏度优于肌酸激酶同工酶(CK-MB)，血清水平升高时间窗较肌钙蛋白(TnI)早，故有利于急性心肌梗死的早期诊断及预后评估[6]。有研究提示脓毒症患者早期H-FABP即有增高，其可能影响疾病预后[7]，但瑞舒伐他汀是否影响其表达目前鲜有报道。本实验发现CLP组H-FABP水平明显增高，伴随心肌坏死病理改变明显，提示H-FABP增高可反映脓毒症心肌损害；ROS组其水平有明显下降，心肌病理损害减轻，提示瑞舒伐他汀可影响脓毒症时H-FABP的水平。由于脂肪酸是心肌重要能量供给，心肌内H-FABP大量释放入血严重影响心肌能量代谢，本实验提示瑞舒伐他汀可有效降低脓毒症心肌损害时血清H-FABP水平，对维持心肌能量代谢有重要作用。

TLR是一种跨膜蛋白，其广泛分布于多种免疫细胞表面，TLR4是TLR家族中一个成员。当TLR4被激活后，其信号通路可诱导多种炎症因子表达释放，参与免疫反应及消除病原体，但过度激活导致免疫紊乱造成器官损害[8]。目前发现心肌细胞表面分布TLR4，近期实验提示TLR4通路参与了脓毒症心肌损害[9]，其通过过度激活炎症介质等造成心肌损害，但瑞舒伐他汀是否通过影响TLR4相关通路减轻脓毒症心肌损害，目前鲜有报道。本研究提示CLP组TLR4 mRNA水平明显增高且心肌损害严重，提示其介导了脓毒症心肌损害过程；ROS组其表达显著下降，心肌病理损害减轻，提示瑞舒伐他汀通过减少TLR4表达，减轻心肌炎性损害，表明瑞舒伐他汀有一定的抗炎作用。MDA是体内脂质过氧化物的代谢产物，其水平高低可体现机体受氧自由基损伤程度。近来研究提示严重脓毒症时存在活性氧超负荷，其可诱发严重氧化应激反应，损伤细胞膜性结构，加重脓毒症器官损害[10]。本实验发现CLP组MDA水平明显上升伴随心肌病理损害加重，提示过度氧化应激反应参与了脓毒症心肌损害，ROS组其表达显著下降，相关病理损害较轻，提示瑞舒伐他汀通过抗氧化作用减轻脓毒症心肌损害。

miRNA是内源性非编码的小分子RNA，其中miR-1是新近受关注的miR之一，在心肌细胞中高表达，其参与了细胞分化、增殖、凋亡等多个过程[2]。新近研究发现miR-1与多种心血管疾病有关[3]，但具体作用机制不详，目前成为研究热点。关于miR-1在脓毒症心肌损害中的作用目前未见报道。本实验发现脓毒症心肌损害大鼠miR-1明显下降，瑞舒伐他汀治疗后其水平有所上升，同期病理损害较轻，这提示脓毒症心肌损害时其可能作为一种心肌保护因子，瑞舒伐他汀通过影响其表达从而减轻心肌损伤。目前miR-1在不同心血管疾病中表达及作用不一。有研究发现急性心肌梗死小鼠模型中，miR-1水平升高明显[11]，miR-1升高与心肌梗死后心律失常的发生有关[12]。但也有研究发现，胞内miR-1表达可以促进心脏祖细胞分化，改善心肌梗死后心肌细胞修复[13]。新近研究提示上调miR-1水平可抑制pi3k/akt/mtor信号通路，改善表阿霉素引起的心脏毒性[14]。综合目前关于miR-1在心血管疾病尤其脓毒症心肌病中的作用仍未明确，其是否存在不同浓度产生不同治疗结局，仍需进一步研究。

综上所述，本研究提示严重脓毒症时，过度炎症反应、氧化应激等多因素参与了心肌损害。miR-1在脓毒症时可能作为一种心肌保护因子减轻脓毒症心肌损害。同时瑞舒伐他汀通过影响H-FABP、TLR4 mRNA、MDA及miR-1等相关因子水平，可有效减轻脓毒症心肌损伤，其为临床用药提供一定治疗依据。