两种检测方法评价ACS患者服用氯吡格雷后的血小板反应性 及其与CYP2C19基因多态性的关系

梅竹，侯智为,2，才艺，赵晓杰，田孝祥，刘晶，刘丹，闫承慧*

1北部战区总医院心血管内科/全军心血管病研究所，沈阳 110016；2锦州医科大学研究生院，辽宁锦州 121001

采用氯吡格雷行抗血小板聚集治疗是经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)患者术后抗血栓的首选方案[1]。目前越来越多的研究结果显示，部分患者服用氯吡格雷后的抗血小板聚集效果不佳，仍存在血小板高反应性(high on-treatment platelet reactivity，HTPR)，这将导致血栓复发、支架内血栓、心肌梗死、卒中或死亡等不良事件的发生风险增加[2-4]。

影响氯吡格雷抗血小板聚集治疗效果的因素较多[5]。研究显示，CYP2C19基因多态性与氯吡格雷的药物反应性密切相关[6]。但是，CYP2C19基因型对服用氯吡格雷的患者具有何种影响，不同基因型患者的抗血小板聚集治疗方案该如何制定等问题还需要检测患者的血小板功能后才能确定。血小板功能检测方法较多且标准不一，国内还没有专门的指南(共识)来规范血小板功能检测。在我国氯吡格雷用药患者中，关于血小板反应性与CYP2C19基因型多态性的关系以及CYP2C19基因多态性是否会影响其用药后的血小板反应性尚无定论[7-8]。为明确流式细胞术检测血小板内血管扩张型刺激磷酸化蛋白(vasodilator stimulated phosphoprotein，VASP)法与光比浊(light transmittance aggregometry，LTA)法测量的血小板反应性与基因型的关系，以及不同检测方法间的相关性，本研究分别使用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和花生四烯酸(arachidonicacid，AA)诱导的光比浊法(ADP-LTA和AA-LTA)以及VASP法检测43例PCI患者采用氯吡格雷抗血小板聚集治疗的效果，并研究这些检测结果与CYP2C19基因型的关系，评价不同血小板检测方法在临床用药中的指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年7-10月在北部战区总医院参与血小板反应性与临床血栓事件研究(PARCTICE研究)的患者43例。男30例，女13例，年龄(59.9±8.9)岁，体重指数(BMI)为(25.36±3.57) kg/m2。患者均明确诊断为急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)，接受了PCI治疗且正在服用阿司匹林(100 mg/d)和氯吡格雷(300 mg/d)，排除合并使用其他抗血小板聚集药物及严重进展性疾病(如恶性肿瘤)者。所有参与者均签署知情同意书。本研究通过北部战区总医院伦理委员会批准。

1.2 观察指标 使用基因芯片技术，根据患者CYP2C19等位基因型将患者分为快代谢型(extensive metabolizer，EM)CYP2C19*1/*1(636 GG，681 GG)；中等代谢型(intermediate metabolizer，IM)CYP2C19*1/*2(636 GG，681 GA)；慢代谢型(poor metabolizer，PM)CYP2C19*2/*2(636 GG，681 AA)。其中携带CYP2C19*2型等位基因者(即IM型和PM型)定义为CYP2C19功能缺陷。服药72 h后，抽取患者静脉血2 ml，在北部战区总医院全军心血管病研究所使用VASP法、ADP-LTA法、AA-LTA法评估血小板反应性。血小板功能测试均在抽血后4 h内完成。

1.3 指标分析 比较3种基因型患者临床特征的差异以及不同血小板检测方法与基因型的差异性；根据不同血小板检测方法结果的75%位点将43例患者分为血小板高反应性(high on-treatment platelet reactivity，HTPR，11例)及非高反应性(non high ontreatment platelet reactivity，nHTPR，32例)，比较血小板反应性的差异；比较3种血小板检测方法检测结果间的相关性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 24.0软件进行统计分析。连续变量以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例(%)表示，组间比较采用χ2检验，结果有差异时进一步比较采用Bonferroni检验；采用Pearson相关分析不同血小板检测方法结果的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同CYP2C19基因型患者的临床特征指标比较 本研究43例患者中，CYP2C19基因型为EM型17例(39.5%)、IM型19例(44.2%)、PM型7例(16.3%)。PM型、IM型患者的VASP检测结果均高于EM型患者，PM型患者的AA-LTA法检测结果高于IM型及EM型患者，差异有统计学意义(P<0.01，表1)。血小板反应性与CYP2C19基因型分析结果显示，VASP法中PM型与EM型患者、IM型与EM型患者检测结果比较差异有统计学意义；AA-LTA法中EM型与PM型患者、IM型与PM型患者检测结果差异有统计学意义(P＜0.05，图1)。

2.2 不同CYP2C19基因型患者的血小板反应性比较 由VASP法和AA-LTA法检测的HTPR比例大小均为PM型>IM型>EM型，差异有统计学意义(P<0.05)；ADP-LAT法检测的3种基因型的HTPR比例差异无统计学意义(P>0.05，表2)。

表1 不同CYP2C19基因型患者的临床特征比较Tab.1 Clinical characteristics of patients with different CYP2C19 genotypes

2.3 3种血小板检测方法检测结果间的相关性

AA-LTA法与ADP-LTA法的检测结果呈正相关(r=0.496，P<0.001)，AA-LTA法与VASP法结果呈正相关(r=0.383，P=0.011)，ADP-LTA法与VASP法结果呈正相关(r=0.369，P=0.014，图2)。

图1 血小板反应性检测结果与CPY2C19基因多态性的差异性箱式图Fig.1 Boxplot of the difference between platelet reactivity and CPY2C19 gene polymorphism

表2 不同CYP2C19基因型患者的血小板反应性比较Tab.2 Platelet reactivity in patients with different CYP2C19 genotypes

3 讨 论

本研究使用两种血小板反应性检测方法(VASP法和LTA法)评估43例ACS患者PCI后使用氯吡格雷的抗血小板聚集效果与CYP2C19基因型间的关系，同时评估VASP法与LTA法检测血小板功能的相关性。本研究所有患者中携带CYP2C19基因缺陷型(IM型与PM型基因)患者的比例为60.5%(26/43)，高于欧美国家(29.1%～30.8%)[9-10]，与几项关于亚洲人的研究结果较一致(43.4%～62.0%)[11-13]。

本研究结果显示，患者血小板反应性受CYP2C19基因多态性的影响。VASP法及AA-LTA法检测的HTPR比例大小均为PM型>IM型>EM型，提示针对氯吡格雷抗血小板聚集治疗患者进行CYP2C19基因型检测的必要性；对CYP2C19基因缺陷的患者应格外关注其服用氯吡格雷药物期间的血小板反应性。临床上应针对不同基因型患者制定个性化的抗血小板聚集治疗方案，以降低PCI后血栓等不良事件的发生率。

图2 3种血小板检测方法检测结果间的相关性分析Fig.2 Correlation analysis among the results of three methods for platelet detection

由于血小板有多种激活途径[14-15]，不同的血小板功能检测方法可以通过不同的原理反映血小板的反应性，但目前尚无结论表明任何一种血小板检测方法具有绝对的优势[16-17]。每种检测方法只能从单一角度评价血小板功能，均有自身的优点及缺陷。例如，血小板受到刺激后会分泌含有ADP的致密颗粒，随后刺激嘌呤能受体P2Y12。VASP是一种细胞内血小板蛋白，VASP磷酸化表示P2Y12受体被抑制。使用流式细胞仪测定VASP水平，能够特异性地反映P2Y12的表达及激活状态。但检测VASP水平很耗时，并且需要经验丰富的实验室人员来操作[18]。 血小板活化还可使磷脂酶A2活化，从而释放出AA。AA随后将通过环氧合酶(COX)转化为前列腺素H2(PGH2)，然后将其转化为血栓烷A2(TXA2)。TXA2将穿过血小板膜并与前列腺素受体(TP)结合，进一步增强血小板活化。LTA法人工添加血小板激活诱导剂AA或ADP使血小板活化。活化后的血小板聚集，使血液的透光度增加，通过测量透光度反映血小板凝聚力。LTA法是最早被认可，也是使用最广泛的血小板功能检测方法。但是该方法的诱导剂剂量使用不一致，并受操作时间、温度等影响，难以在不同实验室进行统一检测[19]。

患者CYP2C19基因型属于遗传特征，基本不受外界因素影响。本研究发现，通过VASP法检测血小板反应性与CYP2C19基因型的相关性最高，有研究报道由于VASP法可以检测P2Y12受体活性，因此该方法与使用氯吡格雷进行抗血小板聚集治疗的血小板功能检测具有较高的特异性[20-21]。

此外，AA-LTA主要反映阿司匹林用药后血小板的反应性，但仍不清楚它与CYP2C19基因型存在的相关关系，考虑可能有两个原因：一是样本量偏少，致使检测结果存在一定偏倚；二是在服用阿司匹林的患者中，血小板高反应性人群中CYP2C19慢代谢型比例较高，因而出现了统计学差异。但是否由于患者为CYP2C19慢代谢型而导致阿司匹林用药后的血小板高反应性，目前尚未见相关报道。笔者将在后续研究中通过扩大样本量来进一步观察。

目前，常用的血小板功能检测方法还有Verify Now、血栓弹力图法(TEG)、多电级凝集法(MEA)等，但无论哪种方法都无法全面地反映血小板功能[16]。 目前临床上仍无指南明确指出如何选择血小板功能检测方法。但考虑到各种检测方法的局限性，常常同时使用两种以上血小板功能检测方法，当结果出现矛盾时还应根据临床症状等全面评估后再决定是否调整治疗方案。本研究结果显示，CYP2C19基因EM型及IM型患者通过VASP法检测的血小板反应性存在明显差异，且这两种基因型患者的血小板抵抗不严重，因此建议对EM型及IM型患者使用VASP法检测，而PM型患者在治疗中容易出现血小板抵抗，有较高的血栓性疾病风险，因此建议参考AALTA与ADP-LTA结果，并根据临床症状及时调整治疗方案。

综上所述，CYP2C19基因多态性与氯吡格雷用药后患者血小板的高反应性密切相关。由于VASP法、AA-LTA法和ADP-LTA法之间的相关性较低，且单一检测方法很难全面反映血小板功能，因此进行血小板功能检测仍需使用两种以上方法相互印证。