GA和BA激素调控对马铃薯杂交结实的影响

李佩华，杨亚辉，彭正松，蔡光泽，方志荣

(西昌学院, 四川 凉山 615013)

【研究意义】马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界四大粮食作物之一，其营养价值高、产量高、适应性强，发展马铃薯产业对于国家粮食安全具有重要意义[1]，为此我国提出了马铃薯主粮化。随着战略不断推进，马铃薯种质资源的需求更加多元化，因此对育种工作提出了更高的要求。【前人研究进展】我国的马铃薯育种工作可追溯到上世纪，育种既有品种间杂交、诱变育种及芽变育种等传统方式，也有新起的航天育种、分子标记辅助育种及细胞工程技术育种等新方式，但四倍体栽培种间的杂交仍是主要的育种方式[2-4]。品种间杂交是通过收获马铃薯杂交产生的浆果，对浆果中的实生籽进行育苗，后进行选育的技术[5]。但马铃薯为典型的自花授粉作物,杂交的结实率较低[6]，其杂交结实除受父母本品种特性的影响外，还受外界气象条件和杂交技术的影响[7]。为此，许多学者提出了采用优质种薯、应用气雾栽培法、搭架法、重复授粉、抱砖法、套麦秆法、施用化学药剂等方法来提高马铃薯结实率[8-12]。此前已有师理[13]、白小娟[14]、谢婉[15]等学者发现运用植物激素GA和BA能促进马铃薯的开花结实。【本研究切入点】本试验主要通过在孕蕾期对马铃薯母本喷施GA3和6-BA，辅助以套麦秆和搭架技术，研究各激素组合混合喷施对马铃薯杂交结实的影响。【拟解决的关键问题】旨在为马铃薯田间杂交育种提供一定技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料：米拉、乌洋芋、南13-15、凉薯97优质种薯若干(西昌学院马铃薯课题组提供)。

试验试剂：醋酸洋红溶液(天津兰翼生物科技有限公司)、蓝墨水(上海精细文化用品有限公司)、氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液(上海博微生物有限公司)、GA3(杭州木木生物科技有限公司)、6-BA(杭州木木生物科技有限公司)。

试验器材：FA2204N电子天平(上海菁华科技仪器有限公司)、Nikon ECLIPSE80生物显微镜(株式会社尼康)、剪刀、镊子、铅笔、MITIR温湿度计(温州市米特尔智能科技有限公司)、网袋、园艺标签挂牌。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计及田间种植 本试验采用单因素随机区组设计，每个杂交组合共设置5个激素处理组合以及1个清水对照(表1)，3次重复。每小区起4垄，垄距1 m，每垄播2行，株距0.35 m，小区宽4 m，长7 m，小区面积28 m2。小区内不开沟，区组间及四周开0.5 m深沟，四周设保护行，试验面积575 m2，另外选取水肥均匀的地块种植父本100 m2，一个杂交组合试验面积为675 m2，总试验面积为2025 m2。

1.2.2 父母本的选择 马铃薯存在天然不育性，对杂交结实有很大影响，故父母本的选择十分重要。胚乳平衡数假说提出，每个种都存在一个有效的倍性，在种间杂交时，胚乳中母本与父本的比例必须是2∶1，只有这个比例才能杂交成功[16]。除此之外，马铃薯杂交母本宜选择本地适应性强并存在自然结实率较高的材料，父本宜选择花粉活力较高与且与母本存在性状差异的材料[17]。依据课题组多年对64份优良材料的田间观察记录，本次试验选择的杂交组合为：①米拉(♀)×乌洋芋(♂)，②南13-15(♀)×米拉(♂)，③凉薯97(♀)×乌洋芋(♂)。父母本主要性状见表2。

1.2.3 父本花粉活力测定 父本花粉活力测定对马铃薯杂交具有重要意义,据马铃薯父本选择的研究可知花粉活力高于50 %适合做父本[18]。马铃薯花粉实验于下午5：00-6:00采集父本花粉，将其分别放入装有冰袋的泡沫箱带回实验室。先进行干燥处理，再装在PCR管中在-20 ℃条件下保存花粉[19]。后分别用醋酸洋红染色法、蓝墨水染色法-和氯化三苯基四氮唑(TTC)法[20-22]3种方法对花粉进行活力测定，在显微镜下观察，不仅要统计花粉的活力，而且还要观察花粉粒的饱满度。

1.2.4 杂交技术 杂交育种能有效的提高马铃薯种质资源的开发，而马铃薯杂交结实不仅受本身遗传的限制，而且受外界温湿度影响大，据研究可知在温度18～23 ℃、湿度80 %～90 %时杂交结实率较高[23]，故试验选在早上8:00-10:00进行杂交操作。同时由于试验杂交时间较长，为避免人为及天气变化因素对试验结果的影响，故在杂交操作时每一区组由1人完成，为保证足够的杂交花朵数，可分多天进行。

具体步骤[24]如下。整理花序：用剪刀对母本花枝进行整枝处理，将已经开过、未开以及发育不良的花朵剪去，一株马铃薯留2～4朵花。授粉：花粉采取现采现用的方式，取父本花粉抖落在大拇指指甲盖上，然后让其接触雌蕊柱头，不能让花粉混杂。套麦秆：麦秆剪成2～3 cm长度，麦秆要比雌蕊长，将其套在已授粉的雌蕊上，这样可以免去雄，减少对母本花朵的伤害，从而提高杂交结实。套袋：写上父母本和日期，对杂交的花序挂牌，杂交成功后杂交浆果长到1cm左右就可以进行套袋操作，用网袋套上杂交果，以避免自然掉落。

表1 处理编号

表2 父母本主要性状

1.2.5 田间管理 在杂交期间，将温湿度计置于田间，测定试验地的温度和湿度，从而选择适宜的温度湿度范围进行杂交操作，杂交前可适时浇水，以保证土壤的湿度以及降低环境温度。到马铃薯苗长到一定高度时，对杂交马铃薯母本采取垄内搭架措施，增加通风透光，减少马铃薯苗倒伏情况，以便于后期杂交操作。将植物激素处理组合浓度配置好后，1∶1的配比混合，在现蕾初期对母本马铃薯的顶部进行喷施。同时为保证马铃薯浆果正常成熟，应当注意防治晚疫病，在马铃薯晚疫病发生初期或始花期应用银法利药剂(68.75 %氟菌·霜霉威)进行喷施，以及防治害虫啃食浆果。

2 结果与分析

2.1 开花影响

马铃薯的开花与结实有着密切的联系，通过在马铃薯孕蕾期使用GA和BA植物激素的调控能促进开花繁茂，开花数量多，除此之外，使用植物激素还能够延长马铃薯花期，可以使花期延长到30 d以上，从而使父母本花期相遇，促进马铃薯的杂交结实。

2.2 花粉活力

由图1可知，使用醋酸洋红染色法、蓝墨水染色法和氯化三苯基四氮唑(TTC) 法3种方法测定的花粉活力存在一定差异。乌洋芋采用醋酸洋红染色法测定的花粉活力较高，米拉采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定的花粉活力较高，但3种方法测定的结果都高于50 %，说明乌洋芋与米拉适合做父本。

2.3 杂交结实率

对各杂交组合的试验结果进行方差分析可知，米拉(♀)×乌洋芋(♂)、南13-15(♀)×米拉(♂)及凉薯97(♀)×乌洋芋(♂)的处理间F值分别为42.690、28.272、52.356均大于F0.01(5，10)=5.64，说明3种杂交组合的各处理间处理效果差异均达到了极显著水平，还需进一步进行多重比较。采用最短显著极差法(SSR法)进行多重比较，各杂交组合的处理结实率多重比较结果见表4。

表3 父母本开花习性

2.3.1 米拉(♀)×乌洋芋(♂)的杂交结实率 由表4可知，使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3处理组合的杂交结实率最高，达到了71.57 %，调控效果明显，喷施清水对照组的结实率平均值最低，只有19.57 %。各激素组合处理的结实率高低为：20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3﹥10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3﹥30 mg/L 6-BA+40 mg/L GA3﹥50mg/L GA3﹥20 mg/L 6-BA﹥喷施清水CK。由字母标记结果可知，在5 %的显著水平与1 %极显著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素组合与另外5种激素组合的处理效果差异显著。

2.3.2 南13-15(♀)×米拉(♂)的杂交结实率 由表4可知，使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3处理组合的杂交结实率最高，达到了54.11 %，调控效果较明显，喷施清水对照组的结实率平均值最低，只有16.73 %。各激素组合处理的结实率高低为：20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3﹥10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3﹥30 mg/L 6-BA+40 mg/L GA3﹥20 mg/L 6-BA﹥50 mg/L GA3﹥喷施清水CK。由字母标记结果可知，在5 %的显著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素组合与另外5种激素组合的处理效果差异显著，在1 %的极显著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素组合与10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3效果差异差异不显著，与其他的激素组合处理效果差异极显著。

2.3.3 凉薯97(♀)×乌洋芋(♂)的杂交结实率 由表4可知，使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3处理组合的杂交结实率最高，达到了68.43 %，调控效果明显，喷施清水对照组的结实率平均值最低，只有18.20 %。各激素组合处理的结实率高低为：20mg/L 6-BA+50 mg/L GA3﹥10 mg/L 6-BA+60 mg/L GA3﹥30 mg/L 6-BA+40 mg/L GA3﹥50 mg/L GA3﹥20 mg/L 6-BA﹥喷施清水CK。由字母标记结果可知，由字母标记结果可知，在5 %的显著水平与1 %极显著水平下，20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3的激素组合与另外5种激素组合的处理效果差异显著。

图1 父本花粉活力Fig.1 Paternal pollen vigor

表4 结实率多重比较结果

注：小写字母表示5 %显著水平，大写字母表示1 %极显著水平。

2.4 千粒重

待浆果成熟(果实发黄发亮具有清香味)后适时收获，放置于通风阴凉处，使其完成后熟。待杂交果变软后将实生籽洗出，放置通风干燥处晾干，称量千粒重。然后将标明各杂交组合的实生籽分别放入纸袋中进行存放。从表5可知，同一杂交组合的千粒重相差不显著，只有不同杂交组合间存在千粒重的差异，不同处理下杂交组合的千粒重差别不显著。

3 讨 论

3.1 环境因素的影响

马铃薯为长日照作物, 凉山州因有得天独厚的自然环境, 誉为全国最佳马铃薯种植区域之一，孕育出许多独特的马铃薯品种资源[25]，普格县五道箐乡属于典型高二半山区，常年日照充足，因此在高海拔地区马铃薯结实率一般比低海拔地区高，长时间光照能有效促进马铃薯的植株生长和有性生殖过程，促进开花坐果，减少花的脱落，增加开花数量和提高花粉活力。除此之外，温度、湿度的控制与马铃薯杂交结实密切相关，在温度、湿度适宜的条件下能显著提高马铃薯杂交的结实率。如果温度低于18 ℃，花芽可能不分化，也可能形成花芽但不开花，高于25 ℃时，马铃薯花粉母细胞可能会死亡，导致花粉的育性降低[26]，过于干燥，花粉难以粘在雌蕊上，杂交不易成功，故需要实时测定田间的温度湿度，选择适宜的时间或采取控温控湿技术措施，以提高杂交成功率。

表5 不同处理的杂交组合千粒重平均值

Table 5 The average 1000-grain weight of hybrid combinations with different treatment (g)

3.2 不同杂交组合的影响

马铃薯杂交组合的选择对育种影响很大[27]，不同杂交组合的结实能力差异比较大。在本试验中20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3处理使马铃薯杂交结实率达到最高，但不同杂交组合的结实率高低不同，植物激素的处理对不同杂交组合的影响不一致，杂交结实率与杂交组合的选择有关。亲本的选育为马铃薯杂交结实提供依据，马铃薯一些不同品种的开花特性存在很大的差异，许多亲本存在天然的雄性不育、花粉败育以及胚乳败育，造成结实率极其低，在选择时父本则需要花粉量大，花粉活力高的，母本则需要天然结实性好的，而且需要亲本组合花期相近以及亲和力高，从而促进马铃薯杂交的结实率。在选择杂交组合时，亦可以引进原始栽培种、新型栽培种以及野生栽培种[28]，选择出优良亲本用于杂交育种，提高种质资源的利用开发。

3.3 杂交操作的影响

杂交操作的熟练度对马铃薯杂交结实有重要的意义。要求操作人员熟练和仔细，要了解马铃薯的花器构造，在整个杂交过程都需要小心，仔细取父本的花粉在指甲盖上，轻轻地将大拇指指甲盖与母本雌蕊接触，为避免花粉混合，每次重新取粉时，需要用纸将指甲擦拭干净，在授粉后用准备好的麦秆套住雌蕊，防治雨水的冲刷，而且可以不用去除杂交花朵的雄蕊，减少操作的失误性，从而促进马铃薯杂交的结实。本试验与其他杂交试验的套袋不同，是在结果以后再进行套网袋操作，防止杂交果脱落。

3.4 植物激素的影响

植物激素的处理能有效促进马铃薯开花，有效防止花柄节离层的产生，提高杂交结实率。BA的主要生理作用为促进开花，增加坐果率以及促进果实的生长[29]，BA能够有效延长马铃薯的开花时间，从而促进杂交父母本的花期相遇。GA的主要生理作用为：抑制地下块茎形成, 从而改变地上部与地下部的营养分配，促进花序发育，增加开花结实能力[30]。GA能诱导单性结实，形成无籽果实，试验结果未出现这种现象，均为有籽果实，但试验没有计算单果产籽量以及单果产籽粒，以及没有进行实生籽的萌发试验，无法详细解释植物激素GA对实生籽的影响。植物激素的使用都是有严格的范围控制，过多会有抑制作用，所以在使用植物激素时，一定要把握好浓度。根据试验结果显示，GA和BA混合使用时的杂交结实率比单独使用的高，但促进马铃薯杂交开花结实能力到底是GA还是BA单独使用更好，还需要进一步验证。在蒙蕊学的研究中，没有使用植物激素的处理，杂交结实率最高仅有29 %[31]，而在本次试验中，马铃薯最高杂交结实率达到71.57 %。

4 结 论

通过选择优良的父母本、改善田间管理措施、选择适宜的温湿度进行杂交操作以及进行植物激素的处理，使马铃薯杂交结实率得到极大的提高，能使米拉(♀)×乌洋芋(♂)的杂交结实率达到71.54 %、南13-15(♀)×米拉(♂)的杂交结实率达到54.11 %、凉薯97(♀)×乌洋芋(♂)的杂交结实率达到63.29 %，虽然不同的杂交组合结实率有差异，在马铃薯孕蕾期使用20 mg/L 6-BA+50 mg/L GA3处理马铃薯顶部，试验效果最佳，能明显促进开花，并且延长花期，显著提高马铃薯的杂交结实率。