液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中阿维菌素、伊维菌素及四种三苯甲烷类残留

袁斯甜，伍华雯，罗秋红，黄海军，吉丽华，占春瑞

（南昌海关技术中心，江西 南昌 330002）

阿维菌素（AVM）和伊维菌素（IVM）属于阿维菌素类药物（AVMs），是一种高效、广谱的大环内酯类杀虫药物；孔雀石绿（MG）、结晶紫（CV）及其代谢物（隐性孔雀石绿LMG和隐性结晶紫LCV）是一种三苯甲烷类化合物，既是染料，也是一种抗菌、杀寄生虫的药物。两类药物价格低廉、用量少，并且具有很好的杀菌效果，广泛应用于水产养殖业疾病防控[1]。研究表明：AVMs用作兽药，代谢的药物主要通过粪便以原型排出，严重污染水体，未代谢的药物残留在水产品中对水生生物以及人类带来潜在的危害；另外三苯甲烷类化合物是一种致癌物质，在水生物体内残留时间可达100 d以上，通过食物链对人类身体造成严重伤害，具有致畸、致癌等危害，我国将MG、CV也列入兽药禁用药清单[2]。为保障水产品质量以及水产养殖业的健康发展，需严格监控水产品中AVMs和三苯甲烷类残留。

目前有关检测AVM和IVM的方法多采用液相色谱-荧光法[3-8]，液相色谱-串联质谱法[9-13]；孔雀石绿及其代谢物多采用液相色谱法[14-18]，液相色谱荧光法[19-21]，液相色谱-串联质谱法[22-26]。目前AVMs残留检测方法大都建立在动物源性食品，而在水产品中研究报道甚少，并且同时测定水产品中阿维菌素、伊维菌素及四种三苯甲烷类残留的方法尚未报道过。对于目前水产品中AVMs和四种三苯甲烷类药物残留，采用的是分类检测，利用不同的检测方法和前处理进行分类检测，不仅耗时耗力、成本高，并且很难满足大批量样品检测要求。因此，发展同时测定水产品中多兽药残留的方法已成为迫切需求。

该文基于固相萃取技术，结合液相色谱-串联质谱法，建立了同时测定水产品中阿维菌素、伊维菌素及四种三苯甲烷类残留的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

4000Qtrap液相色谱－串联质谱仪（AB Sciex公司）；Sartorious电子天平（精度 0.01 mg和 0.01 g）；SI G560E型旋涡混匀器；Eppendorf 5430R冷冻高速离心机；N-EVAP112氮吹浓缩仪；Visiperp DL固相萃取装置；Alumina－N固相萃取小柱（1 g/3 mL）；有机系微孔滤膜0.2 μm。

阿维菌素、伊维菌素、孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫六种标准物质和两种氘代内标（MG－D5和LMG－D6）的纯度均不低于98%。

标准储备溶液：1 000 mg/L，分别称取适量的上述六种标准物质和两种氘代内标于10 mL容量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，-18℃保存于棕色玻璃瓶中。使用前用乙腈稀释成合适浓度的混合标准使用液和混合内标标准使用液。

甲醇、乙腈、乙酸、无水乙酸铵均为HPLC纯；试验用水由Milli-Q超纯水系统制备。

5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液（含0.1%乙酸）：称取0.385 g无水乙酸铵溶解于900 mL水中，加入1 mL乙酸，用水定容至1 000 mL。

1.2 仪器检测条件

1.2.1 色谱条件 Waters C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），柱温 30 ℃；进样量 10 μL；四种三苯甲烷类流动相A为乙腈，B为5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液，梯度洗脱程序为0～2.5 min，A由70%升至95%；2.5～7.0 min，A 保持 95%；7.0～7.1 min，A 由95%降至70%；7.1～15 min，A保持70%。AVMs流动相A为乙腈，B为水，其等度洗脱程序为0～5 min，A为95%。

1.2.2 质谱条件 四种三苯甲烷类为ESI正离子模式扫描（ESI+），多反应监测（MRM）模式，雾化气压力（GAS1）：45 psi，辅助气压力（GAS2）：55 psi，气帘气压力（CUR）：10 psi，电喷雾压力（IS）：5500 V；AVMs为APCI负离子模式扫描（APCI-），多反应监测（MRM）模式，雾化气压力（GAS1）：40 psi，辅助气压力（GAS2）：12 psi，气帘气压力（CUR）：13 psi，电喷雾压力（IS）：-4 500 V。

其他质谱参数见表1，其中带*为定量离子。

表1 质谱参数

1.3 样品前处理

取约500 g水产品肌肉组织，用高速匀浆机匀浆，制成鱼糜样品。

1.3.1 提取 称取5.00 g鱼糜样品置于50 mL具塞塑料离心管中，加入40 ng孔雀石绿、隐性孔雀石绿混合内标，加入乙腈11 mL，涡旋混匀，均质提取30 s，4200 r/min离心5 min，上清液转移至25 mL比色管中。另取一套离心管加入11 mL乙腈，洗涤均质刀头，洗涤液提取残渣一次，涡旋超声5 min，4200 r/min离心5 min，合并提取液，用乙腈定容至25mL，摇匀备用。

1.3.2 净化 移取上述5 mL提取液加入中性氧化铝柱（预先用5 mL乙腈活化）中，用5 mL乙腈进行洗脱，上样即接收。收集液于40℃下氮吹至干，加入1 mL乙腈－5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液（1+1），涡匀后过滤膜，进行液相色谱-串联质谱仪测定分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为

在鱼糜阴性样品中添加阿维菌素、伊维菌素及四种三苯甲烷类六种混合标准溶液。4.0 μg/kg AVMs色谱图见图1；0.5 μg/kg四种三苯甲烷类色谱图见图2。所有待测目标组分均能获得最佳色谱分离效果且峰型尖锐，表明该方法能够有效的分离水产品中AVMs和四种三苯甲烷类残留，建立了水产品多药残同时检测的简便方法，为日常检测节约成本，并且有效缩短检测时间。

图 1 4.0 μg/kg AVMs色谱图

图2 0.5 μg/kg四种三苯甲烷类色谱图

2.2 提取试剂的选择

综合考虑AVMs和四种三苯甲烷类结构特点，均易溶于有机试剂。试验常用的有机试剂有乙腈、甲醇、乙酸乙酯和二氯甲烷等。因此，该试验分别采用这四种试剂对添加AVMs和四种三苯甲烷类标准物质的鱼糜样品进行提取。结果表明：乙酸乙酯和二氯甲烷对样品中的目标物提取率低；甲醇和乙腈对四种三苯甲烷类提取效果好且无明显差异，而对于AVMs，乙腈提取效果更好。相对乙腈，甲醇极性强更易将样品基质中的极性杂质提取出来。因此，本试验选择乙腈作为提取试剂，能有效提取六种目标物并去除杂质的干扰。

2.3 净化方式的选择

该试验选择中性氧化铝固相萃取柱，其能有效地适用于芳香烃以及酸碱溶液中不稳定的含酯化合物的分离，其试验结果表明：采用中性氧化铝固相萃取柱，添加回收高，且对提取液中油脂和杂质成分也有很好的净化效果。另外，该试验采用5 mL乙腈洗脱，可将固相萃取柱中残留的目标物完全洗脱下来，防止过量的洗脱液将吸附的杂质洗脱下来。

2.4 流动相的选择

从待测组分的分离效果和离子化效率选择流动相。对于四种三苯甲烷类，采用的是ESI正离子模式扫描，流动相直接选用样品上机的定溶液，即乙腈和5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液，由于这四种三苯甲烷类具有弱碱性，试验表明流动相中加入适量的乙酸和低浓度的挥发性缓冲盐可提高待测组分的离子化效率，待测组分得到了很好的色谱分离效果且峰性尖锐。AVMs采用的APCI负离子模式扫描，乙酸铵-0.1%乙酸体系呈弱酸性抑制AVMs离子化效率，采用乙腈和水流动相，5min等度洗脱程序即可将AVM和IVM有效的分离。

2.5 标准曲线和检出限

考虑实际样品测定，可能存在基质效应的影响。试验分别采取纯试剂和阴性基质样品提取液配制相同浓度的混合标准工作溶液，在相同仪器条件下测定目标物的响应值并进行比较。试验结果表明：纯试剂配制的混合标准工作溶液的响应值和阴性基质提取液配制的响应值无明显差异，故试验选择纯试剂配制混合标准曲线。

采用纯试剂配制成质量浓度为0.25/2.0、0.5/4.0、1.0/8.0、2.0/16、4.0/32 和 10/80 μg/L 的混合标准工作溶液，按照标准方法测定，AVMs采用外标法，在2.0～80 μg/L质量浓度范围呈线性，检出限为4.0 μg/kg；四种三苯甲烷类采用内标法，在0.25～10 μg/L质量浓度范围内具有良好的线性相关，检出限为0.5 μg/kg。其六种目标待测物线性参数和检出限见表2。

2.6 精密度与回收试验

分别在鱼糜阴性样品中添加3个浓度水平的AVMs和四种三苯甲烷类六种混合标准溶液，按实验方法和仪器条件进行测定，分别计算六种目标物的加标回收率和相对标准偏差RSD（n=6），结果见表3。六种目标物的平均回收率为89.8%～113%，RSD为1.4%～10%，表明该试验方法的回收率和重现性好。

表2 线性参数和检出限

表3 加标回收率和精密度（n=6）

3 结论

该文建立了液相色谱-串联质谱同时测定水产品中阿维菌素、伊维菌素及四种三苯甲烷类药物残留。从试验结果来看，准确性、灵敏度、精密度和检出限均满足兽药残留检测要求，从而说明同时测定水产品中AVMs和四种三苯甲烷类残留的方法是有效可行的，并且本方法大大减少日常检测时间与成本，为日常水产品中多兽药残留分析提供有利检测手段。