微小RNA-155/含有SH2结构的5肌醇磷酸酶-1与非酒精性脂肪性肝病患者发生心血管事件的相关性

王 凡， 孙 武， 马玉林， 蒋红君

云南省第一人民医院(昆明理工大学附属医院) 检验科， 昆明 650032

近年来，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)发病率呈逐年上升趋势，已经成为临床最为常见的非感染性肝脏疾病[1]。NAFLD是由非过度饮酒或其他明确肝损伤因素所导致的，以肝细胞内出现大量的脂肪沉积为主要特征[2]。研究[3]显示，脂肪肝与心血管病之间存在着密切联系。NAFLD是代谢综合征在肝脏中的表现，而代谢综合征是导致动脉粥样硬化以及临床心脑血管事件发生的主要原因之一[4]。有学者[5]提出，NAFLD不仅是心血管疾病的发生标志，甚至是心血管疾病的早期中间状态。目前，微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)作为理想的心血管疾病标志物之一，对心血管疾病的早期诊断、临床风险评估以及预后判断等方面均具有重要作用[6-7]，本研究旨在分析miR-155及其靶基因含有SH2结构的5肌醇磷酸酶-1(SH2-containing inositol phosphatase-1, SHIP-1)与NAFLD患者心血管事件的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年3月-2019年7月本院收治的NAFLD患者，作为NAFLD组；并选择同时期在本院健康体检的健康志愿者作为对照组。纳入标准：(1)符合2010年《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[8]中相关诊断标准；(2)对照组志愿者无内科相关疾病、代谢性疾病等。排除标准：(1)合并风湿性心脏病、瓣膜病、心肌病、肺心病患者；(2)合并酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、药物性肝损伤以及肝硬化等肝脏疾病患者；(3)合并恶性肿瘤、甲状腺功能亢进、肾脏疾病或服用影响肝功能药物患者；(4)妊娠期及哺乳期妇女。

1.2 方法

1.2.1 常规指标检测 测量两组受试者身高及体质量，计算BMI；测量血压，包括收缩压(SBP)及舒张压(DBP)；抽取两组受试者清晨空腹静脉血，检测受试者空腹血糖(FPG)、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil水平。FPG检测采用葡萄糖氧化酶偶联比色法(GOD-POD法)，其余指标检测采用全自动生化分析仪，检测严格参照试剂盒使用说明书进行。

1.2.2 miR-155及SHIP-1 mRNA检测 采用荧光定量PCR法检测miR-155及SHIP-1 mRNA，采用Trizol法提取外周血全血总RNA，测定RNA浓度、纯度以及完整性，采用TaKaRa公司RNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。采用引物设计软件Premier5.0分别设计mRNA及基因荧光定量PCR引物，具体见表1，引物合成由上海生工生物技术有限公司完成。以25 μl/孔qPCR反应体系进行荧光定量PCR反应，包括12.5 μl SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)、1.0 μl Gol Forward Primer、1.0 μl Uni-miR qPCR Primer、0.5 μl ROX Reference Dye(50×)、2.0 μl cDNA溶液、8.0 μl dH2O。反应条件为95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 11 s共进行40个循环。PCR扩增产物进行琼脂凝胶电泳，以GAPDH作为内参基因，采用△△Ct法计算基因相对表达量。

表1 PCR引物序列

1.3 伦理学审查 本研究已通过云南省第一人民医院伦理委员会批准(批号：2017伦审第51号)，所有受试者均签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 共纳入NAFLD组104例，对照组110例。NAFLD组中男68例、女36例，年龄43～65岁，平均年龄(52.17±8.92)岁，病程3个月～16年，平均病程(4.18±1.39)年，病情轻度62例、中重度42例。对照组中男65例、女45例，年龄45～60岁，平均年龄(51.20±9.83)岁。经比较，两组受试者性别、年龄差异均无统计学意义(P值均>0.05)，具有可比性。

2.2 两组各指标比较 两组SBP、DBP水平差异均无统计学意义(P值均>0.05)，NAFLD组患者BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT、TBil水平明显高于对照组，HDL-C水平明显低于对照组，miR-155 mRNA相对表达量明显高于对照组，SHIP-1 mRNA相对表达量明显低于对照组，且miR-155/SHIP-1值、心血管事件发生率均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)(表2)。

2.3 不同miR-155/SHIP-1值NAFLD组患者各指标比较 参考文献[6]，根据患者miR-155/SHIP-1值将患者分为3组，3组间DBP、SBP水平差异均无统计学意义(P值均>0.05)，而3组BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil心血管事件比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表3)。

表2 两组受试者各指标比较

表3 不同miR-155/SHIP-1值NAFLD组患者各指标比较

注：1)与≤2组比较,P<0.05；2)与2～3组比较,P<0.05。

表4 miR-155/SHIP-1值与各指标相关性分析

2.4 miR-155/SHIP-1值与各指标相关性分析 miR-155/SHIP-1值与BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT及TBil呈显著正相关(P值均<0.05)，与HDL-C呈显著负相关(P<0.05)(表4)。

2.5 miR-155/SHIP-1值对患者心血管事件发生预测价值 发生心血管事件的NAFLD患者miR-155/SHIP-1值为3.642±1.082，未发生心血管事件的NAFLD患者miR-155/SHIP-1值为2.237±0.703，前者明显高于后者，差异有统计学意义(t=11.104，P<0.05)。采用ROC曲线分析miR-155/SHIP-1值对患者心血管事件发生预测价值，ROC曲线下面积为0.902(图1)。

3 讨论

NAFLD是由于非酒精因素所导致的一类肝细胞内脂肪过度沉积型疾病，属于一种代谢应激性肝损伤，具有较高的发生率，且患者可进一步发生成为肝硬化，需引起临床工作者的重视[9]。近些年来，国内多项研究显示NAFLD与心血管事件的发生具有密切联系[10]。心血管事件发生的主要病理基础为动脉粥样硬化，分子生物学研究[11]显示，NAFLD可通过过氧化应急、内分泌激素、炎症以及糖脂代谢异常等多种途径损伤机体动脉内膜，继而导致动脉粥样硬化的发生。目前，心血管事件已经成为NAFLD患者死亡的主要原因[12]。

miRNA属于转录本长度在22～25 nt范围内的非编码RNA，可通过对靶基因转录和翻译的调控来影响细胞的生化、分化、增殖以及凋亡。miR-155不仅能够对机体进行免疫调控，同时还能够参与机体的各种炎症过程[13]。此外，在激活的免疫细胞中可发现miR-155高表达，并且通过免疫调节细胞分化以及细胞因子的分泌参与机体的免疫调控反应过程[14]。研究[15]显示，miR-155与机体炎症因子(包括IL-6、TNFα以及IFNγ)表达密切相关，miR-155表达的升高可能是严重心血管意外发生的重要机制之一。SHIP-1是miR-155重要的作用靶点，可抑制巨噬细胞所引发的炎症反应。由于miR-155与SHIP-1 mRNA 3’端UTR相结合，当miR-155表达增高时，可导致SHIP-1表达的明显降低[16-17]。有报道[18]miR-155/SHIP-1表达与经皮冠状动脉介入术后患者严重心血管事件的发生密切相关，但是关于miR-155/SHIP-1表达与NAFLD患者心血管事件的发生关系，目前尚无相关报道。

本研究结果显示，两组受试者血压SBP、DBP比较差异均无统计学意义，NAFLD组患者BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT以及TBil明显高于对照组，NAFLD组患者HDL-C水平明显低于对照组；同时NAFLD组患者心血管事件发生率明显高于对照组，上述结果与既往研究[19-20]结果相似，提示NAFLD患者出现糖脂代谢以及肝功能异常，且心血管事件发生率较正常健康人群明显升高。此外，本研究结果提示NAFLD患者可见miR-155/SHIP-1表达异常，miR-155表达升高而SHIP-1表达降低。进一步分析miR-155/SHIP-1值与NAFLD患者糖脂代谢及心血管事件发生的相关性，结果显示，NAFLD患者miR-155/SHIP-1表达异常与糖脂代谢及肝功能密切相关，可能是疾病进展的重要机制。采用ROC曲线分析miR-155/SHIP-1值对患者心血管事件发生预测价值，提示NAFLD患者miR-155/SHIP-1表达情况可有效预测患者心血管事件的发生，进一步显示miR-155/SHIP-1在NAFLD患者心血管疾病进展过程中发挥着重要作用。

综上所述，NAFLD患者出现明显的糖脂代谢及miR-155/SHIP-1表达异常，其糖脂代谢及肝功能异常与miR-155/SHIP-1表达密切相关。因此，miR-155/SHIP-1表达可有效预测患者心血管事件发生。