徐州地区HBV感染者逆转录聚合酶区基因耐药变异特点及耐药影响因素分析

李 莎， 彭华彬， 李淑芹， 周 静， 汪莉萍

徐州医科大学附属医院 感染性疾病科， 江苏 徐州 221002

HBV感染是一个重要的全球性问题，是导致乙型肝炎肝硬化(LC)和肝细胞癌(HCC)的主要原因[1]。长期使用核苷(酸)类药物(NAs)可通过抑制HBV复制来降低此类疾病的发生[2]。然而，NAs很少能实现慢性HBV感染的功能性治愈[3][即：停止治疗后仍保持HBsAg阴性(伴或不伴抗-HBs出现)、HBV DNA检测不到、肝脏生物化学指标正常、肝脏组织病变改善]，大多数患者需终生服用NAs，其治疗的最大障碍是不能根治乙型肝炎和易产生病毒耐药。NAs治疗失败与HBV DNA逆转录聚合酶(reverse transcription polymerase，RT)区域的突变有关。HBV基因型耐药突变分为两种类型[4]：原发耐药变异和补偿变异，前者包括RT区中的rtA181V/T、rtM204I/V/S、rtN236T和rtM250V/L等相关突变，是导致NAs治疗敏感性降低的主要原因。后者包括RT区中的rtVl73L、rtLl80M、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtV214A、rtQ215S、rtL233V和rtN238H等相关突变，可以恢复RT活性，该变异主要由原发耐药变异引起。因此，HBV的复制潜力[5]可以通过补偿变异得以不断维持。随着NAs的广泛应用，耐药突变模式变得越来越复杂，NAs新的可疑耐药位点不断被发现。深入了解HBV感染者RT区变异特点和分析影响耐药的危险因素至关重要，可为国家和本地区抗病毒治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2014年5月-2019年4月于徐州医科大学附属医院感染科实验室行HBV RT区基因序列检测的患者。所有病例均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新)》[6]诊断标准，同时排除合并其他嗜肝病毒感染或人类免疫缺陷病毒感染者、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、血吸虫性肝硬化、药物性肝损伤及遗传代谢性肝病等其他可能引起肝损伤的疾病。既往是否使用过NAs或PEG-IFNɑ不作为本研究的排除标准。

1.2 研究方法

1.2.1 病毒学与生化学指标检测 血清标志物检测：采用美国Abbott I2000全自动微粒子化学发光免疫分析仪定量检测。HBsAg检测范围为(0.05～250)IU/ml，大于250 IU/ml时采用1∶500自动稀释检测，HBeAg检测下限为0.50 PEIU/ml，小于0.50 PEIU/ml定义为HBeAg阴性。HBV DNA检测：采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪定量测定HBV DNA，检测下限为 500 IU/ml。生化学指标检测：采用Beckman Coulter AU5800全自动生化分析仪检测。ALT、AST、GGT、ALP、Alb、TBil(正常值参考范围分别为 9～50 U/L、15～40 U/L、10～60 U/L、42～128 U/L、40～55 g/L、0～20 μmol/L)。上述指标均为患者行HBV RT区基因序列检测时的同步实验室数据。

1.2.2 HBV耐药基因突变位点检测及基因型检测 HBV耐药基因突变位点检测：利用ABI基因测序仪3130对HBV DNA>1.0×103拷贝/ml的标本进行检测。已知拉米夫定(LAM)耐药位点：rtV173L、rtL180M、rtM204I/V/S、rtV207I/L/G、rtS213T；阿德福韦酯(ADV)耐药位点：rtA181V/T/S、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN/H238T/D；恩替卡韦(ETV)耐药位点：rtI169M、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtM204V/I、rtM250V/L；替比夫定(LDT)耐药位点：rtL180M、rtM204I/V/S；替诺福韦酯(TDF)耐药位点：rtP177G、rtA194T、rtF249A、rtA181V/T、rtN236T。HBV基因型分析：采用Chromas2.0软件对HBV DNA P基因片段核苷酸编码氨基酸的差异和变异类型进行分析，将测序结果与Genbank中已知的HBV不同基因型野生株序列进行比较，从而确认感染的HBV基因型。

1.3 伦理学审查 本研究已通过徐州医科大学附属医院伦理委员会批准(批号XYFY2020-KL081)。

2 结果

2.1 HBV耐药突变模式分析 本研究共纳入242例患者，男192例，女50例，年龄14～81岁，平均年龄44.51岁。其中118例患者有明确NAs用药史且发生已知耐药位点变异，在118例患者中共检出35种不同的HBV耐药突变模式，以rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S、rtL180M+rtS202G/I+rtM204I/V/S 检出频率多见。其中，单位点突变45例，双位点41例，其余32例为多位点突变。已知耐药位点变异发生在B基因型4例，C基因型114例，未发现其他基因型(表1)。

2.2 不同HBV基因型患者临床特征分析 入组的242例患者中，B基因型13例，C基因型229例。其中B基因型患者ALT水平明显高于C基因型，差异有统计学意义(P<0.05)，其余各项指标组间比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

表1 118例患者耐药突变模式

2.3 不同HBeAg状态患者临床特征分析 入组的242例患者中，HBeAg阴性66例，HBeAg阳性176例。HBeAg阴性患者年龄明显高于HBeAg阳性患者，HBV DNA、HBsAg明显低于HBeAg阳性患者，差异有统计学意义(P值均<0.05)。HBeAg阴性患者CHB人数所占比例低于HBeAg阳性患者，LC、HCC人数所占比例高于HBeAg阳性患者，差异有统计学意义(P<0.05)。HBeAg阴性患者病程、GGT水平明显高于HBeAg阳性患者，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表3)。

表2 HBV 感染者B、C基因型临床特征分析

表3 HBeAg阴性、HBeAg阳性HBV 感染者临床特征分析

2.4 影响HBV RT区耐药变异的危险因素 在242例HBV 感染者中，除118例有明确NAs用药史且发生已知耐药位点变异外，另有46例既往有明确NAs用药史，但未发生已知耐药位点变异，将这164例纳入影响HBV RT区耐药变异的危险因素分析中。以患者是否耐药为因变量，分别以性别、年龄、诊断、病史、家族史、基因型、HBeAg、HBsAg、HBV DNA、ALT、AST、GGT、ALP、Alb、TBil、用药情况、疗程、服药情况为自变量。建立二元logistic回归模型。结果显示，家族史、ALT、AST、GGT、Alb、用药情况、服药情况在模型中均有统计学意义(P值均<0.05)(表4)。

表4 影响患者耐药的单因素logistic回归分析

将上述单因素分析中有统计学意义的变量进行多因素logistic回归分析，结果显示，GGT、用药情况、服药情况在模型中差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表5)。GGT>60 U/L的患者发生耐药的风险是GGT≤60 U/L患者的0.160倍；相对于ETV，LAM+ADV、ADV发生耐药的风险分别是ETV用药患者的0.080倍、5.493倍；相对于持续抗病毒治疗，不适当停药患者发生耐药的风险是其5.945倍。

表5 影响患者耐药的多因素logistic回归分析

2.5 17例预存耐药患者的基因型及变异情况 在242例HBV 感染者中，共检出17例临床资料完整的预存耐药患者，呈现出9种不同的耐药变异模式，以rtS213T最多见。其中与LAM相关的耐药变异为9例，与ADV相关的耐药变异为6例，与二者均相关耐药变异有2例，耐药模式为 rtS213 T+ rtV214A。已知耐药位点变异发生在B基因型2例，C基因型15例，未发现其他基因型(表6)。

3 讨论

由于cccDNA和整合HBV DNA的持续存在，慢性HBV感染无法彻底根除，现有抗病毒药物包括NAs或PEG-IFNɑ[7]，二者实现慢性乙型肝炎临床治愈的作用有限。通过对HBV RT区耐药变异特点及相关影响因素的深入分析，可为HBV防治策略更新、新药研制及疫苗研发提供及时可靠的理论依据。

Zhang等[8]调查了中国华北地区行NAs治疗的4055例HBV感染者，结果表明，rtM204I/V/S发生频率最高(13.44%，545/4055)，并且在过去7年中(2010年-2016年)，rtL180M和rtA181T/V逐渐增加，而rtM204I/V/S和rtN236T在2015年之后明显下降。同样，Qian等[9]的研究分析也显示rtM204I/V/S突变的发生率在接受NAs的CHB患者中最高(34.53%，48/138)。本研究的起止时间为2014年-2019年，在118例有明确NAs用药史且发生已知耐药位点变异的患者中，以rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S较为多见，与上述研究结果基本一致。我国慢性乙型肝炎患者的NAs治疗中，存在很多不规范治疗的情况[10],这直接导致ETV耐药频率随着时间推移明显增加。本实验中，ETV耐药发生率高达21%(25/118),主要变异模式为rtL180M+rtS202G/I+rtM204I/V/S(7/25)、rtL180M+rtT184A/G/I/S+rtM204I/V/S(4/25)。有研究[11]表明，rtL180M+rtA181C+rtM204V在临床中可能会引起ETV耐药，rtA181V和(或)rtN236T可使TDF的敏感性下降3～13倍[12-13]，更严峻的是，有报道[14]提示rtA181T/V可能会导致肝癌的发生。目前各大指南[15-16]均推荐ETV和TDF作为一线HBV抗病毒药物，rtL180M和rtA181T/V的增长趋势表明二者未来将面临的巨大挑战。因此更应该注重HBV RT区基因序列的检测，以便更好的调整优化治疗方案。另外，本地区HBV基因型以C基因型为主，B基因型较少，这与中国北方以C基因型为主基本一致。

表6 17例患者的基因型及变异情况

本研究中，B基因型与C基因型HBV感染者仅在ALT水平存在差异，B基因型患者ALT水平明显高于C基因型。有研究者[17]认为HBV基因型与所致疾病临床特征之间没有显著关联，而另一项在肝硬化患者的研究[18]中表明B基因型患者ALT及TBil升高程度比C基因型者明显, 提示B基因型患者的肝损伤程度较C基因型患者严重。本研究中B基因型患者仅有13例，明显低于C基因型患者(229例)，若能扩大样本量则可使研究结果更具参考价值。本研究亦显示，HBeAg阳性患者的HBV DNA、HBsAg、GGT水平均高于HBeAg阴性患者，与鲍腾等[19]的结果相似。这可能与HBeAg阳性患者体内以HBV复制活跃的野生株为主，而HBeAg阴性患者以HBV前C区变异株或C区启动子双变异株为主有关。此外，HBeAg阴性患者的年龄、病程、LC及HCC例数所占比例均高于HBeAg阳性患者，说明随着感染时间的延长，HBV造成的肝损伤程度加重。

对影响耐药的多因素logistic回归分析分析显示，应用ADV治疗、不适当停药是发生耐药的独立危险因素。正常人血清中GGT主要来自肝脏，各种原因导致的肝内外胆汁淤积时可以显著升高。本研究提示高GGT水平引起患者耐药风险降低，其机制有待深入探究。胡高飞等[20]发现NAs不适当停药易诱发慢加急性肝衰竭，长期规范抗病毒治疗对肝硬化患者尤为重要。有学者[21]指出，病毒学突破可由耐药和依从性低下共同导致。本研究表明，不适当停药会使患者耐药风险明显升高，这提示了在临床工作中，需密切关注患者治疗依从性问题，确保患者已经了解随意停药可能导致的风险。此外，现已不推荐低耐药基因屏障药物LAM、ADV作为抗病毒药物首选。多项研究[22-24]表明，HBV DNA也是影响患者是否发生耐药的危险因素，而在本实验中，差异却无统计学意义，可能与病例选择、样本量少等有关，未来尚需进一步动态观察研究。在本研究中，还发现了17例临床资料完整的预存耐药患者，以C基因型、rtS213T和rtV214A耐药模式多见，且以补偿变异为主。

本研究尚存在一定不足，通过直接测序法检测到的病毒种群在病毒准种中通常>20%，这必定会使部分耐药位点无法检出。未来可使用更灵敏的检测方法，如超深度焦磷酸测序法，以实现更高的突变检测率。综上，本地区HBV感染者RT区变异以C基因型、rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S多见。B基因型患者的肝损伤程度较严重。应关注HBeAg阳性患者的HBsAg、HBV DNA水平。对应用ADV治疗的患者，应高度警惕耐药的发生，同时加强对抗病毒治疗的依从性。在NAs治疗失败的患者中，应综合各方因素考虑换用高效低耐药NAs如TDF、TAF或联合IFN治疗。对是否在应用NAs抗病毒治疗之前行HBV RT区基因耐药检测，仍需进一步开展大样本、多中心研究明确。