早期食管癌患者外周血微小RNA-15b和微小RNA-34c的表达水平及其临床意义

武愫斌 李阳阳 陈浩舟

(1 陕西省商洛市中心医院胸外科，商洛市 726000，电子邮箱：vpejv9@163.com；2 商洛职业技术学院护理系，陕西省商洛市 726000)

食管癌是一种常见的消化道肿瘤，多发于中老年人群，且男性发病率高于女性[1]。近年来随着环境及人们饮食结构的改变，食管癌发病率逐年升高[1-2]。食道癌早期症状不明显，多数患者就诊时病情已进展至中晚期，而中晚期食管癌患者预后差，生存率极低[3]。因此，积极寻找早期诊断方法，进而早发现、早治疗，对提高食管癌患者生存质量具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种具有调控功能的短链非编码RNA。miRNA已被证实参与细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡等多种进程，与癌症发展密切相关[4]。例如，有研究显示，miRNA-15b表达水平在大肠癌患者癌组织中显著下调，与癌细胞转移及患者预后差有关[5]；胶质瘤组织中miRNA-15b表达水平明显低于正常脑组织，上调miRNA-15b表达水平可抑制胶质瘤干细胞迁移、侵染[6]；miRNA-34c被证实在宫颈癌组织中呈低水平表达，与肿瘤细胞的增殖和分裂有关[7]；miRNA-34c可抑制口腔鳞状细胞癌细胞活性，而下调miRNA-34c表达水平可促进癌细胞增殖和迁移[8]。此外，多项研究显示miRNA-15b、miRNA-34c均与上皮间充质转化有关[9-10]。然而两者在食管鳞癌中的作用尚不清楚。故本研究通过检测miRNA-15b、miRNA-34c在早期食管癌患者血清中的表达水平，分析两者与临床病理特征的关系以及两者对早期食管癌的诊断价值，以期为临床诊断和治疗食管癌提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年12月至2018年12月商洛市中心医院收治的早期食管癌患者113例(食管癌组)。其中男性64例、女性49例，年龄28～75(58.67±14.82)岁；原发肿瘤-区域淋巴结-远处转移(tumor-node-metastasis，TNM)分期[11]Ⅰ期 63例，Ⅱ期50例；高、中分化76例，低分化37例；鳞癌71例，腺癌42例。纳入标准：(1)经临床表现及组织病理学检查确诊为食管癌；(2)病灶位于黏膜层及黏膜下层，无淋巴结转移，TNM分期[11]为Ⅰ、Ⅱ期的早期食管癌患者；(3)临床资料完整；(4)患者入组前未进行放疗或化疗。排除标准：(1)合并其他部位肿瘤者；(2)患有严重精神疾病者；(3)心、肾、肝脏功能不全者。另选取同期在商洛市中心医院体检的113例健康者为对照组。其中男性66例、女性47例，年龄27～76(59.25±15.63)岁。纳入标准：(1)平时身体素质较好；(2)体检时未发现患有恶性肿瘤。排除标准：(1)患有糖尿病、高血压、冠心病、感染性疾病；(2)肝、肾功能不全；(3)妊娠期、哺乳期妇女。两组的年龄、性别构成比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。研究对象或家属均对本研究知情并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 主要仪器和试剂 实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)仪(美国ABI公司，型号：7500 Fast)，miRNA提取试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，批号：WE0195-KCU)，miRNA反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，批号：ALH266-PTO)，qRT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司，批号：RR420A)。

1.3 检测方法 清晨(7：00～9：00)采集研究对象空腹外周静脉血5 mL，于4℃下3 000 r/min离心10 min后取上清液分装于无菌EP管中，-80℃保存备用。使用miRNA提取试剂盒提取总RNA，再使用反转录试剂盒得到cDNA后。用qRT-PCR试剂盒进行PCR反应，20 μL反应体系包括SYBR®Primix Ex TaqTM10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，cDNA 2 μL，ROX 0.4 μL，无酶水6.8 μL。具体反应步骤：95℃ 30 s，95℃ 5 s，62℃ 20 s，共40个循环。每个样本重复3次。以U6为内参基因，采用2-△△Ct法计算miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 收集资料 收集所有研究对象的一般资料及病理学资料。一般资料包括年龄、性别、体质指数、吸烟史、饮酒史、饮食习惯等。其中吸烟定义为平均每天吸烟≥1支，连续或累积≥1年；饮酒定义为平均每周饮酒≥1次，连续或累积≥1年[12]。病理学资料包括肿瘤大小、组织学分型、分化程度及TNM分期等。

1.5 统计学分析 使用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验；计数资料以[n(%)]表示，比较采用χ2检验；使用Logistic回归分析影响食管癌发生的危险因素；受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线分析miRNA-15b相对表达水平与miRNA-34c相对表达水平对早期食管癌诊断价值。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象一般资料比较 两组年龄、性别、体质指数、吸烟及饮酒情况比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。食管癌组喜食腌制食品、烫食者比例高于对照组，而喜食蔬菜水果者比例低于对照组(均P<0.05)。见表2。

表2 两组研究对象一般资料对比

2.2 两组血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平 食管癌组患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平均低于对照组(均P<0.05)，见表3。

表3 两组研究对象血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平比较(x±s)

2.3 血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平与早期食管癌临床病理特征的关系 不同性别、年龄、肿瘤大小、组织学分型的早期食管癌患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。低分化早期食管癌患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平低于高、中分化患者(P<0.05)；TNM分期Ⅱ期患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平低于TNM分期Ⅰ期患者(P<0.05)。见表4。

表4 不同临床病理特征早期食管癌患者血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平比较(x±s)

2.4 早期食管癌发生的影响因素的Logistic回归分析 以是否发生食管癌为因变量(是=1，否=0)，以是否喜食腌制食品(是=1，否=0)、是否喜食烫食(是=1，否=0)、吸烟(是=1，否=0)、饮酒(是=1，否=0)、miRNA-15b相对表达水平(≤0.78=1，>0.78=0)、miRNA-34c相对表达水平(≤0.69=1，>0.69=0)为自变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，喜食烫食、吸烟、饮酒与早期食管癌发生无关(均P>0.05)，而喜食腌制食品、miRNA-15b相对表达水平≤0.78、miRNA-34c相对表达水平≤0.69是早期食管癌发生的危险因素(均P<0.05)。见表5。

表5 影响早期食管癌发生的因素的Logistic回归分析结果

2.5 血清miRNA-15b相对表达水平和miRNA-34c相对表达水平对早期食管癌的诊断效能 血清miRNA-15b诊断早期食管癌的ROC曲线下面积为0.836(P<0.001)，敏感度为89.50%，特异度为72.70%。血清miRNA-34c诊断早期食管癌的ROC曲线下面积为0.804(P<0.001)，敏感度为63.20%，特异度为83.60%。外周血血清miRNA-15b与miRNA-34c联合诊断早期食管癌的ROC曲线下面积为0.949(P<0.001)，敏感度为93.00%，特异度为81.80%。miRNA-15b、miRNA-34c联合诊断时ROC曲线下面积大于单一指标(z=2.548、P=0.011；z=4.106，P<0.001)。见图1。

图1 血清miRNA-15b、miRNA-34c相对表达水平及两者联合诊断早期食管癌的ROC曲线

3 讨 论

早期食管癌患者吞咽粗硬食物时有哽噎停滞感，喝水之后可缓解。随着病情进展，食管癌患者出现进行性吞咽困难，难以吞咽干硬食物、半流质食物甚至水等。中晚期食管癌细胞易转移至其他部位，造成食管癌患者出现胸背部持续疼痛、呼吸系统感染、腹腔积液、昏迷甚至死亡[12]。早期有效诊断对改善食管癌患者治疗效果、提高患者生存率和生活质量有重要意义。食管癌发病影响因素有饮食习惯(如喜食烫食、喜食腌制食物、水果蔬菜摄入不足)、吸烟、饮酒、口腔不洁、遗传因素等[13]。本研究结果显示，食管癌组喜食腌制食品、烫食者比例高于对照组，而喜食蔬菜水果者比例低于对照组(P<0.05)，与房广梅等[14]的研究结果相似，且Logistic回归分析结果也显示，喜食腌制食品是食管癌发病的危险因素。

MacLean等[15]的研究表明，在卵巢癌细胞中miRNA-15b表达水平下调，其低表达与卵巢癌患者的高临床分期和低生存率有关。此外，miRNA-15b过表达能抑制口腔舌鳞癌细胞的上皮间质转化和肿瘤干细胞表型，为口腔舌鳞癌治疗提供新靶点[9]。本研究结果显示，早期食管癌患者血miRNA-15b相对表达水平低于健康者(P<0.05)，与MacLean等[15]的研究结果相似。本研究结果还显示，miRNA-15b相对表达水平≤0.78是食管癌发生的危险因素(P<0.05)；低分化早期食管癌患者血清miRNA-15b相对表达水平低于高、中分化患者，TNM分期Ⅱ期患者血清miRNA-15b相对表达水平低于TNM分期Ⅰ期患者(P<0.05)。这提示miRNA-15b可能与早期食管癌发生及发展有关。Baraniskin等[16]发现，miRNA-15b鉴别胶质瘤和非胶质瘤的曲线下面积为0.960，灵敏度和特异度分别为90.00%和94.50%，miRNA-15b可作为诊断胶质瘤的生物标志物。本研究结果显示，miRNA-15b诊断早期食管癌的ROC曲线下面积为0.836(P<0.001)，敏感度为89.50%，特异度仅为72.70%。这提示miRNA-15b也可作为诊断早期食管癌的辅助性指标，但诊断效能一般。

有研究表明，miRNA-34c在前列腺癌组织中呈低水平表达，与前列腺癌患者TNM分期有关[17]。Achari等[18]的研究表明，乳腺癌组织中miRNA-34c表达水平下调，与癌细胞的增殖抑制和细胞死亡增加有关。本研究结果显示，食管癌组患者血清miRNA-34c相对表达水平低于对照组(P<0.05)，miRNA-34c相对表达水平0.69是影响早期食管癌发生危险因素(P<0.05)；低分化早期食管癌患者血清miRNA-34c相对表达水平低于高、中分化患者，TNM分期Ⅱ期患者血清miRNA-34c相对表达水平低于TNM分期Ⅰ期患者(P<0.05)。这提示miRNA-34c也与食管癌发生和发展有关。Gao等[19]的研究表明，miRNA-34c诊断乳腺癌的曲线下面积为0.854，灵敏度为72.00%，特异性为88.80%。本研究结果显示，血清miRNA-34c诊断早期食管癌的ROC曲线下面积为0.804(P<0.001)，敏感度为63.20%，特异度为83.60%，与Gao等[20]的研究结果相似，提示miRNA-34c用于诊断早期食管癌的敏感度较低，效能一般。进一步分析发现，血清miRNA-15b与miRNA-34c联合预测早期食管癌的ROC曲线下面积为0.949(P<0.001)，敏感度为93.00%，特异度为81.80%，诊断效能明显提高，这可能是由于两者通过不同机制参与食管癌进展，联合检测可弥补单一检测的片面性，但具体作用机制尚需进一步研究。

综上所述，早期食管癌患者血清中miRNA-15b与miRNA-34c表达水平下调，且表达水平可能与食管癌发生和发展有关。两者联合诊断早期食管癌价值较高。但由于本研究样本量较少，研究方法较为单一，两者在早期食管癌中作用机制还需进一步探究。