亚慢性砷暴露对小鼠心肌细胞凋亡的影响

李瑞华，韩明盛，胡 鑫，马艳琴

（山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801）

砷（As）是一种天然存在的类金属，几乎存在于所有环境介质中，如空气、土壤和水。其中，通过砷污染的地下水造成的慢性砷中毒严重威胁人类和动物健康[1-2]。砷一旦被吸收就会分布到肝、肺、肠壁、脾脏和心脏等器官，对机体造成危害[3]。给予小鼠腹腔注射三氧化二砷（5 mg/（kg·d））10 d，可引起心电图ST段抬高和QT间期延长，心肌氧化应激增加，抗氧化防御能力下降，心肌膜损伤和炎性因子释放[4]。胚胎期亚慢性砷暴露会导致胎鼠心脏畸形，包括室间隔缺损、房间隔缺损和法洛三联征[5]。大鼠胚胎期至青春期砷染毒可导致大鼠收缩压和舒张压升高，心肌细胞发生肿胀、变性等组织病理学改变，电镜超微结构观察到心肌细胞线粒体、闰盘、细胞核均发生不同程度改变[6]。然而对于砷引起心脏毒性机制的认识还不深入。

本试验选用C57BL/6小鼠作为试验对象，通过饮水砷暴露建立亚慢性砷中毒小鼠模型，利用全自动生化分析仪检测血清心肌酶谱水平，评估心肌损伤情况，并采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡，采用实时荧光定量PCR技术检测凋亡通路相关基因的表达，为进一步探讨砷致小鼠心肌损伤的机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物

选取40只5周龄、体质量为20～22 g的SPF级雄性C57BL/6小鼠用于试验。小鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 预饲7 d后，40只小鼠随机分为对照组及低、中、高剂量砷暴露组，自由饮食和采水。对照组小鼠饮去离子水，低、中、高剂量组分别饮含0.15、1.50、15.00 mg/L三氧化二砷（As2O3）的去离子水。试验周期为90 d。所有试验均符合山西农业大学实验动物伦理委员会的章程。

试验结束后，小鼠称质量、麻醉，腹主动脉采血，收集血清于-20℃保存；同时分离心脏组织并称质量，按照公式计算不同浓度砷暴露组间脏器系数后，液氮保存用于基因表达检测；部分心脏置于4%多聚甲醛中固定，用于石蜡切片制作。

1.2.2 血清心肌酶活性测定 采用全自动生化分析仪检测血清心肌酶活力，其中，肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）采用速率法测定；谷草转氨酶（AST）采用苹果酸脱氢酶法测定。

1.2.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡率 心脏组织常规制作石蜡切片，脱蜡至水，利用生物素标记的dUTP（Biotin-dUTP）结合到切片中凋亡细胞DNA暴露的3′-OH端，随后和辣根过氧化物酶（HRP）标记的Streptavidin（Streptavidin-HRP）结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色，于显微镜下观察凋亡心肌细胞。每个样本随机选取5个高倍镜视野进行细胞计数，计算凋亡率。

1.2.4 荧光定量PCR检测心脏基因表达水平 采用Trizol法提取心脏总RNA，测定RNA纯度和浓度。按试剂盒说明书进行反转录反应，SYBR Green法进行qRT-PCR，以β-actin为内参基因，采用2-ΔΔCt法分析Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA的相对表达量。

1.3 数据分析

采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析，组间差异采用one-way analysis of variance（ANOVA）进行分析，Dunnett法进行多重比较检验。

2 结果与分析

2.1 砷对小鼠心脏组织脏器系数的影响

攻毒90 d后，小鼠一般状况良好，各组小鼠全部存活，采食量和饮水量未见明显改变，毛色光亮，反应灵敏。从表1可以看出，不同浓度砷暴露组的小鼠心脏脏器系数均有所下降。其中，中剂量组与对照组相比差异显著（P＜0.05），高剂量组与对照组间差异极显著（P＜0.01）。

表1 不同浓度砷暴露对小鼠脏器系数的影响

2.2 砷对小鼠血清心肌酶活力的影响

表2 不同浓度砷暴露对小鼠血清心肌酶活力的影响 U/L

由表2可知，不同浓度砷暴露后，小鼠血清心肌酶活力与对照组相比，低剂量组各项指标无明显改变，中、高剂量组血清AST、LDH、CK、HBDH活力均显著升高，且随染毒剂量的增加而增加。

2.3 砷暴露对小鼠心肌细胞凋亡及凋亡通路基因表达的影响

采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测不同处理对小鼠心肌细胞凋亡的影响，结果如图1所示。

由图1可知，凋亡心肌细胞核呈棕黄至棕褐色，核形态为长椭圆形，胞质染色较浅。对照组中未发现有凋亡心肌细胞；低、中剂量组中偶见凋亡心肌细胞，多分布在心内膜、心外膜下，凋亡率分别为16.02%、10.64%；高剂量组凋亡心肌细胞的数量明显增加，凋亡率达到24.2%。

采用荧光定量PCR方法检测了不同浓度砷暴露小鼠心脏凋亡通路相关基因的表达量，结果如图2所示。从图2可以看出，与对照组相比，中、高剂量组促凋亡蛋白调节因子Bax的表达显著升高，分别为对照组的1.24倍和1.31倍（P＜0.05）。抗凋亡蛋白调节因子Bcl-2的基因表达量在中、高剂量组均显著降低，分别为对照组的88%（P＜0.05）和62%（P＜0.01）；高剂量组与低剂量组或中剂量组相比，表达量也显著降低，差异具有统计学意义。不同浓度砷暴露后，凋亡效应分子Caspase-3的基因表达均升高，低剂量和中剂量组的相对表达量分别增加了22%和18%，但差异不显著（P＞0.05）；高剂量组Caspase-3的相对表达量增加了46%，差异显著（P＜0.05）。

3 结论与讨论

3.1 砷暴露对小鼠血清心肌酶活力的影响

当心肌组织因多种原因发生炎症、坏死时，心肌细胞中所含的酶类即可进入血液中。因此，血液中心肌酶谱的水平可反映心肌损伤的程度[7-8]。心肌酶谱的测定主要包括：肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）等[9]。CK主要存在于骨骼肌和心肌中，是心肌中重要的能量调节酶[10]。AST也是体内最重要的氨基转移酶之一，心肌中AST含量最为丰富[11]。血清CK、CK-MB、AST灵敏度和特异性均较高，已成为公认的反映心肌细胞损害的“金标准”[9]。LDH几乎存在于所有组织中，以心脏、骨骼肌和肾脏中含量最为丰富。LDH增高主要见于肝炎和心肌梗死等，其同工酶存在明显的组织特异性，可用于心肌疾病的诊断[12]。α-羟基丁酸脱氢酶（HBDH）的本质还是LDH，反映了以羟丁酸作为底物时的LDH1和LDH2的作用，其活力可持续14 d或更长时间[13]。本试验中，1.50、15.00 mg/L As2O3暴露后，小鼠血清中AST、CK、LDH、HBDH的酶活力均显著增加，表明砷暴露对小鼠心肌造成特异性损伤，且随着染毒剂量的增加损伤程度加重。

3.2 砷暴露对小鼠心肌细胞凋亡的影响

细胞凋亡是严格受到细胞信号调控的自主性消亡的过程[14-15]。凋亡通路核心分子家族成员有2个：Bcl-2家族和Caspase家族。Bcl-2家族成员中，有一类抑制凋亡的分子，以Bcl-2分子为代表[16]；还有一类促进凋亡发生的分子，以Bax分子为代表[17]。Caspase家族成员中，一类是凋亡启动分子，包括Caspase-2、8、9、10；另一类是凋亡效应分子，包括Caspase-3、6、7；还有一类Caspase的亚家族分子和凋亡的关系不大[18]。SUN等[19]研究发现，As2O3可显著抑制神经胶质瘤细胞抗凋亡基因Bcl-2的表达，并以时间依赖性方式上调凋亡基因Bax的表达，从而诱导细胞凋亡。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，从而切断核小体间的DNA使其发生断裂暴露3′-OH，因此，可利用TUNEL法来检测细胞凋亡[20]。本试验研究发现，不同浓度砷暴露组中均可见TUNEL阳性凋亡心肌细胞，高浓度砷暴露组凋亡心肌细胞的数量明显增多。通过实时荧光定量PCR检测Bax、Bcl-2以及Caspase-3 mRNA的表达，发现砷暴露上调了小鼠心肌组织中Bax及Caspase-3的表达，下调了Bcl-2的表达，表明亚慢性砷暴露可诱导小鼠心肌细胞发生凋亡。