白杨素纳米结构脂质载体制备及大鼠体内药动学*

刘丹花，马记平，张智强，范明松

(1.郑州澍青医学高等专科学校，郑州 450064；2.天津药物研究院药业有限责任公司，天津 300301；3.上海雷允上药业有限公司技术中心，上海 201401)

白杨素主要来源于葳科植物木蝴蝶[Oroxylumindicum(L.)Vent.]种子、茎皮等，属于黄酮类化合物。最新的药理学研究结果显示，白杨素具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、防止心脑血管疾病等多种药理作用[1-2]。但白杨素溶解度仅为73.53 μg·mL-1[3]，水溶性较差，导致白杨素很难在体内吸收，临床应用受到极大限制。本课题组对白杨素磷脂复合物、固体脂质纳米粒等对白杨素生物利用度的提高情况进行研究[3-4]。但磷脂复合物给药便捷性存在一定问题(半固体状态)，而白杨素固体脂质纳米粒载药量及包封率不高，限制了它们的使用。

纳米结构脂质载体(nanostructured lipid carriers，NLC)[5-6]是在固体脂质纳米粒基础上发展起来的新型脂质纳米载体。NLC是以一定比例的液态脂质或混合脂质代替固体脂质纳米粒的固态脂质[7]，可以提高固体脂质纳米粒的载药量，增加稳定性等特点[8]，受到国内外制剂学者的广泛关注。笔者在本研究将白杨素制备成NLC，并进行质量评价及大鼠体内研究，为白杨素的制剂革新提供实验参考，也为其他难溶性中药活性成分开发研究提供经验[9]。

1 动物、材料与仪器

1.1动物 清洁级SD大鼠，体质量(300±20)g，河南省动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(豫)2016-0001。动物饲养在清洁级实验环境，温度(25±2) ℃，相对湿度(55±5)%。

1.2试药 白杨素(成都嘉叶生物科技有限公司，批号：170530，含量>98.5%)；白杨素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111701-201503)；柚皮素对照品(中国食品药品检定研究院，批号：05-2010)；山嵛酸甘油酯(Compritol 888 ATO，德国BASF公司)；油酸(上海辅必成医药科技有限公司，批号：B20171020T)；甘露醇(天津市富晨化学试剂公司)；泊洛沙姆188(型号：WPEE587E，德国BASF公司)；Solutol HS-15(德国BASF公司)。

1.3仪器 U3000型高效液相色谱仪(戴安中国有限公司，DAD检测器)；DF-101S型磁力搅拌器(巩义市豫华有限责任公司)；AL204型电子天平(赛多利斯仪器北京有限公司，感量：0.01 mg)；XW-80A型涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)；JY92-II型超声波细胞粉碎仪(宁波新知科仪器研究所)；透析袋(截留相对分子质量：10 000，南京森贝伽生物科技有限公司)；MD200-5型氮气吹扫仪(杭州奥威仪器有限公司)；Alpha 1-2LD型冷冻干燥仪(德国Christ公司)；Master-sizer型粒度分析仪(英国马尔文仪器公司)；M110-EH型高压微射流匀质机(美国Microfluidics公司)。

2 方法与结果

2.1HPLC分析方法的建立

2.1.1色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.15%甲酸(65：35)；波长：220 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.1.2溶液配制 白杨素对照品于45 ℃真空干燥箱中放置36 h。精密称取对照品25.0 mg，置于100 mL量瓶中，乙腈超声溶解后，40 min后用乙腈定容，即得250 μg·mL-1白杨素对照品储备液，冰箱密封保存。

2.1.3线性关系考察 取白杨素对照品储备液适量，进一步用乙腈稀释配制成5.0，12.5，25.0，50.0，100.0及125.0 μg·mL-1系列浓度，HPLC进样。以白杨素对照品浓度(C)，与峰面积(A)进行线性回归，得到白杨素的线性回归方程：A=1.181 3C-0.010 9(r=0.999 9)。可见白杨素在5.0～125.0 μg·mL-1浓度范围呈现良好的线性关系。

2.1.4精密度实验 取浓度为5.0，50.0及125.0 μg·mL-1对照品溶液，进行精密度实验。结果显示，低、中、高浓度的日内精密度RSD(n=3)值分别为0.62%、0.27%和0.44%；日间精密度RSD值(n=3)分别为0.74%、0.53%和0.39%。

2.1.5回收率实验 分别于空白NLC溶液中加入低、中、高3种质量浓度白杨素对照品，计算得平均加样回收率(n=3)分别为100.06%，99.84%和100.11%，RSD分别为1.32%、1.68%和0.83%。因此，该HPLC方法可用于白杨素的含量测定。

2.2包封率及载药量的测定 采用超滤法测定白杨素NLC包封率及载药量[7]。量取白杨素NLC混悬液2.0 mL转移至超速离心管(10 kDa)，于温度为0 ℃，转速为12 000 r·min-1(r=15 cm)的条件下离心50 min。收集滤液，HPLC法进样，测定游离白杨素含量(M游离)。精密量取同体积白杨素NLC混悬液转移至25 mL量瓶中，加入乙腈约20 mL，进行超声破坏脂质载体结构后定容，HPLC法进样测定白杨素总含量(M总)。计算NLC的包封率及载药量。包封率(%)=[(M总-M游离)/M总]×100%；载药量(%)=[(M总-M游离)/M质]×100%。式中M总表示白杨素总量，M游离表示游离白杨素的量，M质表示白杨素NLC总质量。

2.3白杨素NLC的制备及工艺优化

2.3.1白杨素NLC的制备工艺 固定白杨素20 mg，称取山嵛酸甘油酯和油酸适量，置于圆底烧瓶，水浴加热(75 ℃)熔融后作为油相。配制1%泊洛沙姆188和1%的Solutol HS-15水溶液，两者按照一定比例混合，加热至相同温度后作为水相。于搅拌速度为1 200 r·min-1条件下，先将水相10 mL缓慢加入到油相中，搅拌20 min后加入剩余水相10 mL，敞口继续搅拌1.5 h即得初乳。初乳于微射流匀质机中在800 MPa下乳匀5次，即得白杨素NLC。空白NLC同法制备。

2.3.2正交实验优化 根据前期白杨素NLC单因素考察结果，以纳米粒的包封率作为评价指标，选择山嵛酸甘油酯用量(A，mg)，油酸用量(B，mg)，表面活性剂体积比(C)，水相体积(D，mL)4个因素为主要影响因素，每个因素设置3个考察水平，见表1，正交实验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交实验设计与结果

由表2可知，各因素对白杨素NLC包封率影响的顺序依次为A>B>C>D，最佳组合为A2B2C1D2，根据方差分析结果，因素A山嵛酸甘油酯用量对白杨素NLC的包封率有显著性差异。综合分析得出优化后的处方：山嵛酸甘油酯为200 mg，油酸用量为40 mg，1%泊洛沙姆188和1% Solutol HS-15水溶液体积比为2：1，水相体积为25 mL。

表3 方差分析结果

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.0

2.4白杨素NLC工艺验证及冻干粉末的制备 按照优化后的处方工艺制备3批白杨素NLC，测试结果显示，包封率为(84.92±1.38)%。白杨素NLC冻干粉末制备工艺为：取NLC混悬液3 mL，置于西林瓶中，加入5%甘露醇。置于-75 ℃超低温冰柜进行预冻2 d，将冷冻后的西林瓶移到冷冻干燥机中2 d，立即封存，即得白杨素NLC冻干粉末。白杨素NLC冻干前后包封率和载药量变化情况结果见表4。

2.5粒径和Zeta电位测定 取制备的白杨素NLC混悬液，用纯化水按照1：4比例稀释后放入比色池中，测定其粒径和Zeta电位。白杨素NLC混悬液粒径和Zeta电位结果见图1和图2。冻干前后粒径和Zeta电位变化情况见表4。

图1 白杨素NLC混悬液粒径分布

Fig.1 Particle size distribution of chrysin nanostructured lipid carrier suspension

2.6白杨素NLC体外释药行为 精密量取白杨素NLC混悬液2.0 mL(以溶出介质配制)，转移至处理好的透析袋中。用溶出介质配制等含量的白杨素混悬液2 mL，置于透析袋中，两端扎紧。供试品中白杨素含量均为10 mg。置于装有纯化水900 mL的溶出杯中，温度为(37±1)℃，转速为100 r·min-1。分别于预定时间点取样2.0 mL，同时补进同温度及同体积的空白溶出介质。HPLC法测定各取样样品的含量，并计算各个时间点的释放量，绘制白杨素及其NLC的体外释放曲线，结果见图3。白杨素混悬液在36 h内累积释放度仅为25.06%，白杨素NLC在36 h内累积释放度为77.33%，释药速率也大大提高，在考察的时间区间内NLC具有明显的缓释特征。

图2 白杨素NLC混悬液Zeta电位

Fig.2 Zeta potential of chrysin nanostructured lipid carrier suspension

表4 白杨素NLC冻干前后包封率、载药量、平均粒径和Zeta电位

样品包封率载药量%冻干前84.92±1.387.22±0.31冻干后81.27±0.427.05±0.44样品平均粒径/nm分散系数(PDI)Zeta电位/mV冻干前217.42±11.060.181±0.072-30.4±3.6冻干后234.67±9.160.213±0.051-28.6±3.0

2.7大鼠体内药动学研究

2.7.1分组及血样采集 取SD大鼠，雌雄兼用，共12只，随机分为2组，每组6只。实验室存放时间约12 h，存放期间禁食，自由饮水。分别灌胃给予SD大鼠白杨素原料药及其NLC混悬液(以纯化水配制)，给药剂量均为50 mg·kg-1。白杨素混悬液组于0.167，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0，8.0和12.0 h时间点眼眶采血约0.3 mL，NLC组于0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，16.0和24.0 h时间点眼眶采血约0.3 mL，血样置于肝素化的离心管中。迅速于转速为3 500 r·min-1(r=15 cm)条件下离心2 min，将上层血浆于-20 ℃冰箱进行冷冻保存。

图3 白杨素及其NLC体外释药曲线

2.7.2血浆样品的处理 按照正己烷-二氯甲烷-异丙醇=(80：40：10)配制提取液。精密取于室温解冻后血浆样品溶液100 μL，柚皮素内标溶液50 μL(浓度为0.5 μg·mL-1)置于离心管中。加入提取液3 mL，涡旋提取3 min。以速度为8 000 r·min-1(r=15 cm)离心5 min，转移上层有机相于40 ℃条件下氮气吹干，残渣以流动相100 μL复溶，继续以转速为8 000 r·min-1离心5 min。取上清液进HPLC测定含量。

2.7.3对照品溶液的配制及方法学考察 柚皮素对照品经干燥处理。精密称取柚皮素对照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇超声溶解后定容，冰箱保存备用。继续用甲醇稀释至0.5 μg·mL-1，作为内标溶液。取“2.1.2”项下白杨素对照品溶液适量，氮气缓慢吹干后采用大鼠空白血浆，配制成0.1，1.0，2.0，4.5，9.0及18.0 μg·mL-1的一系列血浆样品对照品溶液，按照“2.7.2”项下血浆处理方法进行处理。以白杨素浓度为横坐标(X)，白杨素峰面积与柚皮素内标峰面积之比为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程为：Y=181.53C+1.11(r=0.992 0)。通过对血浆对照品进行逐步稀释，发现定量限为43 ng·mL-1，检测限为8.4 ng·mL-1。

设0.1，9.0和18.0 μg·mL-1为低、中、高浓度，进行日内精密度和日间精密度考察。结果显示，低、中、高浓度血浆样品的日内精密度RSD分别为9.33%、6.74%和7.24%(n=3)。白杨素低、中、高浓度血浆样品日间精密度RSD分别为8.51%、6.66%和7.34%(n=3)。取0.2，9.0及18.0 μg·mL-1的血浆样品，分别进行HPLC分析，代入方程计算含量。将测定的质量浓度与实际配制的质量浓度进行对比，计算回收率。结果显示，3种质量浓度的血浆样品回收率在86.57%～94.68%。取白杨素NLC2.0 h时间点的血浆样品，测定时从冰箱取出，测定完成后于冰箱保存，分析6 d内测定白杨素峰面积与柚皮素内标峰面积比值变化情况，结果表明，比值变化的RSD值为1.87%，所以血浆样品在6 d内基本保持稳定。

2.7.4药动学结果 取白杨素原料药及其NLC制剂，分别经大鼠灌胃给药，按“2.7.2”项下方法处理血浆样品，并进行含量检测，药动学曲线见图4。tmax和Cmax采用实测值，药物浓度-时间曲线下面积(AUC)采用梯形法计算，其中，白杨素原料药制成NLC后，tmax由(1.86±0.35)h延长至(3.39±0.88)h；Cmax由(0.44±0.09)μg·mL-1提高至(1.73±0.31)μg·mL-1(P<0.01)，AUC0～t由(4.50±0.63)提高至(13.94±1.94)μg·h·mL-1，相对生物利用度提高到3.10倍；AUC0～∞由(4.91±0.69)提高至(14.76±1.53) μg·h·mL-1(P<0.01)。白杨素NLC的tmax、Cmax及AUC0～t与白杨素原料药相比均差异有统计学意义(P<0.01)，说明NLC改变白杨素在体内的药动学行为。

图4 白杨素及其NLC药-时曲线

Fig.4 Drug concentration-time curves of chrysin and its nanostructured lipid carries

3 讨论

有研究显示，白杨素固体脂质纳米粒包封率为76.63%，载药量为5.27%[6]。笔者在本研究采用山嵛酸甘油酯和油酸作为混合载体制备白杨素NLC，其包封率及载药量分别为(84.92±1.38)%和(7.22±0.31)%，其包封率及载药量相比均有一定程度的提高。分析原因：一方面可能是由于液态脂质增加白杨素在脂质载体中的溶解度，使更多药物被包裹进NLC中[8-9]。另一方面固态和液态脂质的联合使用，增加脂质载体的晶体混乱程度或缺陷，可有效防止药物被排挤出去，因而得到了较高的包封率及载药量。

笔者前期曾经采用微乳法制备白杨素NLC，虽然该法设备要求较低，制备过程简单，但需要加入大量的乳化剂及助乳化剂，有潜在的溶血反应等风险。微射流匀质法由于无需加入有机溶剂，设备工艺参数易于控制，适合大规模化生产，最终采用微射流匀质法进行研究。包封率和载药量的测定方法有高速离心法、透析法及超滤法等，由于高速离心法和透析法测定过程较长，且可能会导致药物发生泄露，因而最终采用超滤法进行测定。

药动学研究结果表明，与白杨素原料药比较，NLC的tmax、Cmax及AUC0～t差异有统计学意义(P<0.01)，其中，tmax大大延长，与白杨素NLC在体外具有明显的缓释特征有关；Cmax极显著性提高，与NLC促进药物吸收有关。总之，白杨素制备成NLC后改变白杨素的体内吸收过程，极显著地提高了白杨素的口服吸收生物利用度，相对生物利用度提高到3.10倍。为充分发挥白杨素的各种药理作用奠定基础，也为白杨素的临床应用提供一种新的研究策略。