菱角壳黄酮提取物抑菌活性评价及对冷鲜鸭肉中假单胞菌生长特性的影响

钟 珍,侯莉莉,王俊南,侯温甫,3,王宏勋,3,王丽梅,3,*

(1.武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北武汉 430023;2.武汉轻工大学生物与制药工程学院,湖北武汉 430023;3.湖北省生鲜食品工程技术研究中心,湖北武汉 430023)

菱角又名腰菱、水栗、菱实,是一种菱科菱属的一年生草本水生植物菱(TrapabispinosaRoxb.)的果实,其营养丰富,用途广泛,是天然的药食兼用型水生草本作物[1],在我国已有上千年的栽种历史。菱角在我国是一种分布广、产量大的水生经济作物,我国菱角主要分布于长江流域和亚热带地区[2],全国约有将近4万hm2的种植面积,年产量约为25万t,其中湖北省菱角的产量为400～500 kg/667 m2[3]。在对菱角的加工中,人们一般只采用其果实部分,菱角壳被直接废弃或者作为燃料使用而造成严重的浪费[4]。据《中药大辞典》归纳,菱壳可治“泄泻、脱肛、痔疮、疗肿、黄水疮、天疱疮”。研究表明,菱角壳富含多糖、黄酮等多种生理活性成分而逐渐受到食品和医药行业的青睐[5],菱角壳中的黄酮类化合物具有一定的抗氧化性[6-7]、抗肿瘤[8]等功效。

近年来,从植物中分离出的天然产物因其低毒、高效的特点,获得众多科研工作者的青睐。黄酮具有抑菌[9]、抗癌[10]、抗氧化[11]、降血糖[12]、降血脂[13]、抗骨质疏松[14]等多种生物活性。现对菱角壳的研究多为其活性成分以及药理作用方面的研究[15-16],而对其在抑菌保鲜方面的研究相对较少[17],其中刘永等[18]利用菱角壳提取物的生理活性作用与壳聚糖制成活性涂膜,发现其对猪肉保鲜有较好的效果,能有效延长冷鲜猪肉的货架期。本实验以湖北种植的二角菱的壳为原材料,提取菱角壳中的黄酮,采用抑菌圈、最低抑菌浓度、液体体系中生长曲线评价菱角壳黄酮提取物对食品中六种常见微生物的抑菌效果,建立假单胞菌在经菱角壳黄酮提取物处理后鸭肉基质中的一级生长预测模型,为开发冷鲜鸭肉天然抑菌剂及菱角壳中活性成分的有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菱角壳 两角菱,采自湖北蔡甸种植地;黄酮粗提物、黄酮纯提物 本实验室制备;鸭肉 湖北鸿翔农业有限公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌、热杀索丝菌、乳酸菌、酵母菌 均由本实验室从其它来源分离纯化后进行16s rDNA鉴定培养;曲酸 国药集团;鸭肉 湖北鸿翔农业有限公司提供;营养琼脂、假单胞选择性培养基、热杀索丝选择性培养基 青岛海博科技公司;AB-8型大孔吸附树脂 天津市海光化工有限公司。

FW177高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;SHZ-D(III)两抽头循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂;RE-2000A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司;HL-1恒流泵、层析柱 上海嘉鹏科技有限公司;XZ-10DTD超声波清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司;SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;DNP-9082型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;芬兰Bioscreen全自动生长曲线分析仪 上海谓载商贸发展有限公司;VORTEX-GENIE1单速漩涡混合器 上海书俊仪器设备有限公司;CP214电子分析天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯;HH-8数显恒温水浴锅 金坛区白塔新宝仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 菱角壳黄酮提取物的制备 将新鲜采摘的菱角去壳后,将壳置于40 ℃烘箱中干燥至质量恒定后粉碎,装入密封袋中,备用。黄酮提取液:准确称取1.0 g菱角壳粉末置三角瓶中,以1∶30的料液比加入50%的乙醇30 mL,在60 ℃下水浴加热30 min过滤得到菱角壳黄酮提取液[19]。黄酮纯化提取液:采用AB-8树脂纯化菱角壳黄酮提取液,纯化工艺为:吸附流速0.8 mL/min,上样体积110 mL,340 mL的70%乙醇溶液洗脱,洗脱样品的流速0.8 mL/min,经纯化后得到菱角壳黄酮纯化提取液,将两种提取液经50 ℃下减压浓缩后再经冷冻干燥得到的粉末即为菱角壳黄酮粗提物和纯化物,其黄酮含量分别为17.50%和36.75%。

1.2.2 菱角壳黄酮提取物抑菌效果的测定 分别称取菱角壳黄酮粗提物、纯化物0.5 g,溶于10 mL的无菌水,经超声、旋涡混合器混合均匀后配制成浓度为50 mg/mL的样液。灭菌后的培养基以每15 mL倒入平板内,培养基温度下降凝固后,将灭菌后冷却到50 ℃的5 mL培养基混入100 μL试验菌(菌悬液浓度为105～106CFU/mL),将试管中的5 mL培养基均匀地铺在已凝固的第一层培养基上,待第二层有供试菌的培养基凝固后,用镊子在其表面上放入牛津杯,并用镊子轻轻按压,使其与培养基表面更好地接触而没有缝隙;在牛津杯内加入200 μL浓度为50 mg/mL经0.22 μm无菌滤头处理的样液,勿使其外溢,无菌水做空白;加完样液后酵母菌、乳酸菌于37 ℃培养48 h,其它菌于30 ℃培养24 h,观察结果,量取直径[20],以出现的抑菌圈大小为判定标准,直径小于8 mm为无抑菌作用。

1.2.3 菱角壳黄酮提取物的最低抑菌浓度(MIC)的测定 取浓度为50 mg/mL的菱角壳黄酮样液,采用二倍稀释法[20],稀释为25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/mL 5个浓度梯度的样品溶液,分别加入培养基中,将受试菌菌悬液接种于各试管中,摇床培养,酵母菌、乳酸菌于37 ℃培养48 h[21-22],其它菌30 ℃培养24 h,比浊法观察试管中培养基的亮度,以透亮无菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓度,考察菱角壳黄酮的抑菌性能。

1.2.4 菱角壳黄酮提取物对液体体系中细菌生长的抑制特性 配制2.5、5、10 mg/mL浓度的样液,用移液枪吸取0.5 mL悬液浓度为105～106CFU/mL的假单胞、金黄色葡萄球菌分别注入5 mL LB培养基中,按照浓度梯度分别添加0.5 mL菱角壳黄酮粗提物、纯化物,漩涡仪混匀后吸取200 μL混有接种菌与药品的培养基接至Bioscreen蜂窝状样品板中,每个样品浓度三个平行,无菌蒸馏水做对照,放置于Bioscreen全自动分析仪检测器上,设定30 ℃培养3 d,每隔2 h自动测定一次,收集数据,处理并绘图[23]。

1.2.5 不同温度下经菱角壳黄酮提取物处理的鸭肉中假单胞菌测定 采用1.2.4实验中抑制效果较好浓度的菱角壳黄酮提取物浸没新鲜宰杀的净膛鸭肉,浸泡10 min后,沥干,进行气调包装(50% O2+30% CO2+20% N2)后,放置于(0±1)、(5±1)、(10±1)、(15±1)、(20±1) ℃的恒温培养箱中贮藏。无菌操作条件下隔天测定菱角壳黄酮提取物处理的鸭肉样品中假单胞菌(参照GB/T 4789.2-2010的测定方法,采用CFC培养基)[24]含量变化。在相同的条件下,用曲酸代替菱角壳黄酮提取物处理鸭肉样品,无菌操作条件下测定假单胞菌含量变化,作为曲酸处理对照组。

1.2.6 生长预测模型的拟合 Gompertz方程如下:

lgN(t)=N0+C·exp{-exp[-B(t-M)]}

式中:N0是初始菌数,lg CFU/g;C为随时间无限增加时菌增量的对数值,lg CFU/g;M是达到相对最大生长速率(U)所需要的时间,d;B是在时间为M时的相对最大比生长速率,d-1[25]。得到以上参数后,代入公式求得最大比生长速率(U)、延滞期(LPD)值。其中,最大比生长速率U=B×C/e,e=2.7182d-1;延滞期LPD=M-(1/B),d。

1.3 数据处理

数据统计分析采用Microsoft Excel 2007、SAS 9.1进行,数值表示为Mean±SD。

2 结果与分析

2.1 菱角壳黄酮提取物抑菌效果的测定

抑菌圈法评价菱角壳黄酮粗提取物、纯化物对6种微生物生长的抑制作用,以出现的抑菌圈大小为判定标准。由表1可见,菱壳黄酮纯化物对假单胞菌、金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用,其抑菌圈直径分别为(47.01±0.43)和(45.06±0.35) mm,菱壳黄酮粗提物对这两种菌有一定的抑菌效果。菱角壳黄酮提取物对热杀索丝菌的抑制作用较弱,粗提物和纯化物的抑菌圈直径分别为(19.33±0.29)和(18.22±0.23) mm。菱角壳黄酮提取物对大肠杆菌和乳酸菌、酵母菌无抑菌圈,显示无抑菌效果。不同的菌群对菱角壳黄酮敏感度不同。抑菌结果如图1和图2。

表1 菱角壳黄酮提取物对六种菌的抑菌圈直径Table 1 Diameter of inhibition zone formed by Trapa bispinosaRoxb.shell flavonoids extract to six types of bacteria

图1 菱角壳黄酮粗提物对六种菌的抑菌圈Fig.1 Inhibition zone formed by Trapa bispinosa Roxb.shell flavonoids crude extract to six types of bacteria注:a:假单胞菌,b:金黄色葡萄球菌,c:热杀索斯菌,d:大肠杆菌,e:酵母菌,f:乳酸菌;图2同。

图2 菱角壳黄酮纯化物对六种菌的抑菌圈Fig.2 Inhibition zone formed by Trapa bispinosa Roxb.shell flavonoids extract purification to six types of bacteria

菱角黄酮壳提取物对假单胞菌、金黄色葡萄球菌和热杀索斯菌有一定的抑菌效果,对大肠杆菌无明显的抑制作用,这与相关文献[26]研究结果一致,但在该研究中显示,菱角壳黄酮提取物对乳酸菌也存在抑制作用,而在本实验中,菱角壳黄酮粗提物和纯化物均对乳酸菌无抑制作用,据相关文献[27]可知,用水蒸气蒸馏法和超临界流体CO2萃取法提取的不同来源菱角的皮或仁的挥发性成分对同种菌的抑制作用不同,这可能是由于菱角的来源、气候、种植方式等导致菱角生物活性成分组成上的差异,也可能是其组成成分比较复杂,成分含量的差别影响了其抑菌效果。

2.2 菱角壳黄酮提取物的最低抑菌浓度(MIC)

根据2.1结果可知,菱壳黄酮粗提物和纯化物对假单胞菌、金黄色葡萄球菌均有较明显的抑制作用,且这两种菌是食品中典型的腐败致病菌,具有一定的代表性,因此挑出这两种菌完成MIC实验,评价菱角壳黄酮粗提物、纯化物的抑菌性能,表明其抑菌强弱。结果见表2。菱角壳黄酮粗提物和纯化物对假单胞菌的MIC值均为3.125 mg/mL,其纯化前后效果一样,但其抑菌圈有明显的差别,这可能是因为提取物本身抑菌浓度相对较高,纯化前后最低抑菌浓度没有变化,但抑菌IC50值有变化,使得抑菌圈变大。菱角壳黄酮粗提物和纯化物对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为12.000和3.125 mg/mL,显示了黄酮提取物纯化后对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于纯化前。

表2 菱角壳黄酮粗提取物、纯化物最低抑菌浓度(MIC)Table 2 The minimum bacteriostasis concentration ofTrapa bispinosa Roxb. shell flavonoids crude extract purification

2.3 菱角壳黄酮提取物对液体体系中细菌抑菌的特性

由图3可知,菱角壳黄酮纯化物对假单胞菌的抑制效果优于黄酮粗提物,其中菱角壳黄酮纯化物三个浓度梯度抑制假单胞菌的吸光度增加值小于0.100,对假单胞菌的抑制作用非常明显,基本使之处于未生长的状态;菱角壳黄酮提取物对金黄色葡萄球菌具有一定的效果,但浓度为10 mg/mL的黄酮提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用较差,仅在后期保持稳定状态。结果表明,添加了不同浓度菱角壳黄酮提取物的假单胞菌和金黄色葡萄球菌生长曲线变化明显,两种菌的吸光值增长幅度相比空白组明显减少。对于同一供试菌而言,不同添加浓度的菱角壳黄酮粗提物和纯化物对微生物生长均有很好的抑制作用,其抑制作用与黄酮提取物的浓度有关;对于菱角壳黄酮粗提物和纯化物而言,纯化物的抑制效果较优于粗提物。所以在液体体系下,菱角壳黄酮提取物能有效抑制供试菌的生长,延缓其生长期,并在后期完全抑制其生长,而结合菱角壳黄酮粗提物、纯化物对假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线来看,浓度为2.5 mg/mL的菱角壳黄酮纯化物对供试菌的抑菌效果最好。

图3 经菱角壳黄酮提取物处理后的假单胞菌和金黄色葡萄球菌的液体生长曲线Fig.3 The liquid growth curve of Pseudomonas and Staphylococcus aureus by Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract注:图a、b分别为经菱角壳黄酮粗提物、纯化物处理后的假单胞菌的液体生长曲线;图c、d为经菱角壳黄酮粗提物、纯化物处理后的金黄色葡萄球菌的液体生长曲线。

2.4 鸭肉上菱角壳黄酮纯化物对假单胞菌菌落数的影响

由2.3实验结果可知,浓度为2.5 mg/mL的菱角壳黄酮纯化物对供试菌的抑菌效果最好,且对假单胞菌有明显的抑制作用,因此选用浓度2.5 mg/mL的菱角壳黄酮纯化物处理鸭肉。由图4可知,在10、15和20 ℃件下,菱角壳黄酮纯化物对假单胞菌的抑制作用较弱,当假单胞菌数超过107CFU/g[28]说明鸭肉变质。15和20 ℃组的冷鲜鸭肉货架期为2 d;在0和5 ℃条件下,菱角壳黄酮纯化物能有效地抑制假单胞菌的增殖,在第10 d,5 ℃条件下,假单胞菌数为7.42 lg CFU/g>7 lg CFU/g,达到腐败标准;在整个储藏期间,0 ℃条件下的冷鲜鸭肉未达到腐败标准,与高温组相比,低温组可将冷鲜鸭肉的货架期延长至8 d以上。

图4 不同温度下菱角壳黄酮纯化物处理鸭肉后鸭肉中假单胞菌菌落数变化Fig.4 The change of total Pseudomonas on duck meat treatedunder Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract at 0～20 ℃

2.5 菱角壳黄酮纯化物处理后鸭肉中假单胞菌生长预测模型构建

鉴于生活中肉类的新鲜程度不一,因此其鸭肉中假单胞菌的初始菌落数也存在差别,所以采用生长预测模型来评价鸭肉中假单胞菌的增殖状况。在本实验中,菱角壳黄酮纯化物处理鸭肉和对照组曲酸处理的鸭肉中假单胞菌的生长曲线应用Gompertz模型拟合。

运用SAS软件拟合回归获得不同恒定温度下鸭肉中假单胞菌的各参数。由表3、表5可以看出决定系数R2的值较高,在0～20 ℃范围内随温度升高R2值逐渐变大,表明Gompertz方程能很好地拟合不同温度下假单胞菌的增殖动态,温度高的决定系数值高,拟合效果好。利用Gompertz模型拟合得出的假单胞菌生长动力学参数见表4表、6,在0～15 ℃下,经菱角壳黄酮纯化物处理后的鸭肉中假单胞菌最大比生长速率(U)均小于曲酸对照组,20 ℃时,曲酸对照组的最大比生长速率(U)大于菱角壳黄酮提取物,表现了其在0～15 ℃储藏时,菱角壳黄酮提取物作为保鲜剂的抑菌效果较好,能够有效延长食品保质期,但随温度升高,其抑菌能力逐渐减弱。

表3 不同温度下假单胞菌菱角壳黄酮纯化物处理后生长动力学模型Table 3 Growth kinetics model of Pseudomonas treated under Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract at 0～20 ℃

表4 不同温度下假单胞菌菱角壳黄酮纯化物处理后生长动力学参数Table 4 Growth kinetics parameters of Pseudomonas treatedunder Trapa bispinosa Roxb. shell flavonoids extract at 0～20 ℃

表5 不同温度下假单胞菌曲酸处理后的生长动力学模型Table 5 Growth kinetics model of Pseudomonas added preservative at 0～20 ℃

表6 不同温度下假单胞菌曲酸处理后的生长动力学参数Table 6 Growth kinetics parameters of Pseudomonasadded preservative at 0～20 ℃

3 结论

菱角壳黄酮提取物对假单胞菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,对热杀索丝菌有一定的抑制效果,其中黄酮纯化物对假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果更好,抑菌圈直径分别为(47.01±0.43)、(45.06±0.35) mm;菱角壳黄酮提取物对大肠杆菌和乳酸菌、酵母菌无抑菌效果。菱角壳黄酮粗提物和纯化物对假单胞菌的MIC值均为3.125 mg/mL,可能是因为提取物本身抑菌浓度相对较高,纯化前后最低抑菌浓度没有变化,其对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为12.000和3.125 mg/mL,显示了黄酮纯化物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于粗提物;而在液体体系下,菱角壳黄酮提取物能有效抑制假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长,延缓其生长期,并在后期完全抑制其生长,且初步确定浓度为2.5 mg/mL的菱角壳黄酮纯化物对供试菌的抑菌效果最好。继而采用对供试菌抑菌效果最好的菱角壳黄酮纯化物浓度(2.5 mg/mL)处理后的鸭肉储藏在不同温度下,发现0和5 ℃可将冷鲜鸭肉的货架期延长至8 d以上,并且通过建立假单胞菌在经浓度为2.5 mg/mL的菱角壳黄酮纯化物处理后的鸭肉基质中的一级模型可知,在0～15 ℃储藏时,菱角壳黄酮提取物作为保鲜剂的抑菌效果较好,能够有效延长食品保质期,有开发为天然抑菌剂的潜力。