日粮添加乳酸菌对苏尼特羊肌纤维类型及肉品质的影响

白艳苹,侯艳茹,孙雪峰,侯普馨,苏 琳,赵丽华,靳 烨,*

(1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018;2.内蒙古乌拉特中旗家畜改良站,内蒙古乌拉特中旗 015300)

乳酸菌是目前食品工业中广泛使用的绿色安全的饲料添加剂,其主要代谢产物,诸如酸性代谢产物、胞外多糖、乳酸菌素、γ-氨基丁酸等在畜牧生产领域具有很大的应用价值。乳酸菌能有效降低抗生素的用量,提高幼龄动物的成活率和生长性能,调节动物肠道微生态平衡,增强机体免疫力,提高饲料转化率,提高日增重,降低养殖成本,有利于产出优质安全的奶、肉产品,提高产品的附加值和市场竞争力[1-3]。

肌纤维是骨骼肌组织的基本结构单位,肌纤维密度和不同类型肌纤维的数量比例和面积比例都与肉品质密切相关,也是动物出生后肌肉生长的重要参数。大量的研究表明,当氧化型肌纤维比例高时,肌肉的肌内脂肪含量、肉色、pH较高,肌肉的保水性较好,肉质细嫩多汁,肉品风味更好。肌纤维的数目虽在出生时就已基本确定,但肌纤维是动态结构,可以根据以下途径从一种类型转换为另一种类型:Ⅰ↔Ⅱa↔Ⅱx↔Ⅱb[4]。大量研究已经表明,肌纤维发育过程中易受到品种、性别、年龄、激素、运动、营养、肌肉部位或生理阶段等诸多因素的影响,因此研究如何通过改变肌纤维类型组成进而改善肉品质具有理论与现实的双重意义。

在动物生长发育过程中,日粮中的营养物质通过消化吸收,主要以肌肉和脂肪沉积在动物机体。养分的代谢和流转必然引起机体能量和蛋白质代谢发生改变,并最终影响肉品质[5]。Chen等[6]研究了鼠李糖乳杆菌CF对无特定病原体鸡的生长性能和肉质的益生作用后发现,日粮添加鼠李糖乳杆菌CF显著增加了大腿肌肉的脂肪含量和pH以及胸肌的脂肪含量和色泽。Liu等[7]的研究表明,日粮添加约氏乳杆菌BS15可显著提高肉仔鸡宰后24 h的pH,同时显著降低滴水损失和剪切力。韦良开等[8]开在育肥猪饲料内添加含有乳酸菌的微生态制剂后发现,与对照组相比,宰后45 min,试验组猪肉红度和黄度均显著提高;宰后24 h,试验组猪肉黄度也显著增加,贮存损失显著减少。邬理洋[9]用含有乳酸菌的微生态制剂饲喂断奶仔公猪,结果显示,微生态制剂对肌纤维直径和面积产生一定影响,使猪背最长肌具有更多的氧化型肌纤维和更少的酵解型肌纤维。尽管其他人已经对此进行了一些研究,表明日粮中添加乳酸菌可能对肉品质和肌纤维特性产生不同程度的影响,但这项研究大部分是在其他物种中进行的,关于乳酸菌对羊的肌纤维特性和肉品质的影响鲜少报道,将二者联系起来进行分析的更是少之又少。因此,本研究通过测定肌纤维特性、MyHCs基因表达量、代谢酶活性和肉品质指标,探究在日粮中添加乳酸菌对苏尼特羊的肌纤维类型及肉品质的影响,为乳酸菌制剂在羊的生产中的合理利用提供理论依据和实用参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物 在草原恒通食品有限公司进行屠宰,宰后1 h内取苏尼特羊背最长肌为实验材料;对照组日粮 精饲料(10 kg)、青贮饲料(8 kg)和葵花饼(5 kg),并且每月依次增加精饲料(2 kg)、青贮饲料(8 kg)和葵花饼(5 kg);乳酸菌组日粮 将乳酸菌按照对照组总日粮的0.50%(质量分数)添加至上述日粮中,混合并搅拌均匀;乳酸菌使用乳安邦复合微生态制剂,活菌数≥1.5×109CFU/g,其成分主要包括乳酸杆菌(LactobacilluscaseiHM-09、LactobacillusplantarumHM-10)及其代谢产物，乳酸菌添加量参考乳安邦复合微生态制剂使用说明书;乳安邦 内蒙古和美科盛生物技术有限公司;精饲料 恒牧饲料科技有限公司;青贮饲料、葵花饼 牧民自制;异戊烷 阿法埃莎(天津)化学有限公司;三磷酸腺苷二钠盐(ATP) 北京酷来搏科技有限公司;巴比妥钠 山东西亚化学股份有限公司;氯化钴 天津市福晨化学试剂厂;无水氯化钙、无水乙酸钠 国药集团化学试剂有限公司;硫化铵 上海麦克林生化科技有限公司;异丙醇 上海振兴化工二厂有限公司;RNAiso Plus、TB GreenTMPremix Ex TaqTMII、Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒 大连宝生物工程大连有限公司;苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶试剂盒 南京建成生物工程研究所。

MEV冰冻切片机 德国Slee公司;Leica 4000B显微镜 德国徕卡公司;DSH-300A回旋式水浴恒温振荡器 上海雅荣生化设备仪器有限公司;Eppendorf 5417冷冻离心机 德国Eppendorf生物公司;LightCycler®96实时荧光定量PCR仪 罗氏诊断产品(上海)有限公司;凝胶成像分析系统 美国Bio-Rad公司;BG-power 3500型稳定温流电泳仪、水平电泳槽 北京百晶生物技术有限公司;Biometra PCR扩增仪 北京北方华奥贸易有限责任公司;pH-STAR型胴体pH直测仪 德国Matthaus;C-LM3B型数显式肌肉嫩度仪 东北农业大学工程学院;SYNERGY H1型酶标仪 美国Bio-Tek Instruments公司;TC-P2A全自动测色色差计 上海生物生化实验仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 饲养管理 本实验在内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗哈拉图苏木牧区进行,选择3月龄,体重(16.6±1.49) kg的苏尼特羊24只,随机分为两组:对照组和乳酸菌组,每组12只,公母各半。两组苏尼特羊分别于相同大小的圈中集体饲喂,饲养期间自由饮水、采食,先经过为期15 d的预饲期,以确定乳酸菌添加量对苏尼特羊无腹泻等不良影响,再进行正式实验,全期实验共计105 d。

1.2.2 肌纤维组织学特性测定

1.2.2.1 样品的采集和制片 宰后1 h内取24只苏尼特羊的背最长肌,按照肌纤维的方向,切成0.5 cm×0.5 cm×1 cm的肌肉块,在事先预冷的异戊烷中脱水干燥30 s,再经液氮速冻,取出后装进无酶无菌冻存管,用干冰带回,放在-80 ℃冰箱中保存。每只羊取9～12个肌肉块,制片时将肌肉块放入-25 ℃的冰冻切片机内切片,厚度为10 μm左右[10]。

1.2.2.2 ATP酶染色 用pH4.6的酸性前孵育液对苏尼特羊的背最长肌样品进行ATP酶组织化学染色[11]。

1.2.2.3 肌纤维各项指标的测定 用显微镜彩图分析软件在100倍下观察并分析肌纤维特性,标尺为200 μm,选择2～3个视野,使总肌纤维数目大于1500根[12]。统计每种类型肌纤维的数量,用每种类型肌纤维数量除以总肌纤维数量记为该种肌纤维的数量比例;测量每种类型肌纤维的横截面积,用每种类型肌纤维总面积除以总肌纤维面积记为该种肌纤维的面积比例;用总肌纤维数量除以总肌纤维面积记为肌纤维密度[13]。

1.2.3 肌球蛋白重链基因表达量 屠宰后,采集约100 mg苏尼特羊背最长肌的肌肉样品,装入无酶无菌冻存管中,于液氮中速冻,保存在-80 ℃冰箱中用于提取总RNA。肌肉中总RNA的提取是按照RNAiso Plus的指导使用说明书进行。用1%的琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计检测总RNA的完整性、浓度和纯度。之后再将提取的RNA稀释到500 ng/mL,进行反转录操作,合成cDNA。MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx基因和管家基因GAPDH的引物参照尹丽卿[11]的实验方法进行设计,由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4 酶活性的测定 苏尼特羊背最长肌中苹果酸脱氢酶(Malate dehydrogenase,MDH)、琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)活性的测定按照苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶试剂盒说明书进行。

1.2.5 肉质指标的测定

1.2.5.1 pH的测定 用pH-STAR型胴体直测式pH计测定苏尼特羊背最长肌的pH,测得的最初pH记为pH0;静置排酸24 h后测得的pH记为pH24。

1.2.5.2 色泽的测定 取1.5 cm2的测定面积,使用TC-P2A全自动测色色差仪对肉的亮度值(L*值)、红度值(a*值)和黄度值(b*值)进行测定。

1.2.5.3 剪切力值的测定 将大小约为2.5 cm×3 cm×5 cm的肌肉块放置在密封袋中,经水浴锅(75 ℃)煮制45 min后取出,冷却至室温,再将其切成3 cm×1 cm×1 cm的条状,使用肌肉嫩度仪测定其剪切力值。

1.2.5.4 蒸煮损失的测定 将大小约为2.5 cm×3 cm×5 cm的肌肉块放置在密封袋中,经水浴锅(75 ℃)煮制45 min后取出,冷却至室温,称量煮制前后肌肉块的质量差,再用差值除以煮制前的质量,记为蒸煮损失。

1.3 数据处理

数据是利用SPSS 19.0 数据分析软件进行单因素方差分析(ANOVA)和相关性分析(Pearson系数),文章中所有数值均以平均值±标准误表示,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 日粮添加乳酸菌对苏尼特羊肌纤维特性的影响

2.1.1 苏尼特羊背最长肌的ATP酶染色结果 根据Brooke等[14]的研究,不同类型的肌纤维对酸碱的稳定性不同,Ⅰ型肌纤维的稳定范围为pH3.9～10.4,ⅡA型为pH4.9～10.8,ⅡB型为pH4.5～10.8。因此,经ATP酶染色后,颜色最深的为Ⅰ型肌纤维,颜色最浅的为ⅡA型肌纤维,颜色介于两者之间的为ⅡB型肌纤维[14]。其中Ⅰ型肌纤维为慢速氧化型、ⅡA型肌纤维为快速氧化-酵解型、ⅡB型肌纤维为快速酵解型。

图1 苏尼特羊背最长肌ATP酶染色结果Fig.1 Serial cross-section oflongissimus dorsi stained with ATPase注:A:对照组;B:乳酸菌组。

2.1.2 日粮添加乳酸菌对肌纤维密度的影响 由图2可知,对照组和乳酸菌组的肌纤维密度无显著性差异(P>0.05)。这说明日粮添加乳酸菌对苏尼特羊背最长肌的肌纤维密度无显著影响。对照组和乳酸菌组的肌纤维密度分别为721.0443和784.8612 N/mm2,说明日粮添加乳酸菌具有增加肌纤维密度的趋势。

图2 苏尼特羊背最长肌的肌纤维密度Fig.2 Muscle fiber density inlongissimus dorsi of Sunit sheep注:字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显著(P<0.05);图3～图6同。

2.1.3 日粮添加乳酸菌对肌纤维数量比例的影响 如图3所示,与对照组相比,日粮添加乳酸菌显著提高了苏尼特羊背最长肌的Ⅰ型肌纤维的数量比例(P<0.05),而对ⅡA型和ⅡB型肌纤维的数量比例无显著影响(P>0.05)。这说明乳酸菌具有提高Ⅰ型肌纤维数量比例的作用。该结果与Chen等[15]的研究结果一致,即给小鼠饲喂植物乳杆菌TWK10后发现,小鼠腓肠肌中Ⅰ型肌纤维的数量比例显著升高,且呈剂量依赖性。乳酸菌代谢可产生乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等有机酸,且有研究表明,丁酸钠对小鼠氧化型肌纤维的形成有促进作用[16],因此我们可以推测,代谢物丁酸可能作为一种中间物质,影响肌纤维的组成。

图3 苏尼特羊背最长肌各型肌纤维的数量比例Fig.3 Muscle fiber number compositionin longissimus dorsi of Sunit sheep

2.1.4 日粮添加乳酸菌对肌纤维面积比例的影响 如图4所示,日粮添加乳酸菌提高了苏尼特羊背最长肌的Ⅰ型肌纤维的面积比例(P=0.052),降低了ⅡA型和ⅡB型肌纤维的面积比例(P>0.05)。分析其原因可能是乳酸菌能改善微生态平衡,肠道微生物群在能量平衡和身体组成方面参与了宿主代谢表型的形成,从而影响了肌纤维组成。Yan等[17]将猪的肠道微生物转移至无菌小鼠体内后研究发现,肠道微生物的转移使无菌小鼠具有与猪相似的骨骼肌纤维特性,一些作者认为肠道微生物-肌肉轴可能存在,但一直没有足够的证据证明,而Yan等[17]的研究结果恰好证明了肠道微生物在骨骼肌的生长发育过程中发挥重要作用,与肌纤维特性密切相关。

图4 苏尼特羊各型肌纤维的面积比例Fig.4 Muscle fiber area compositionin longissimus dorsi of Sunit sheep

对比了两组苏尼特羊背最长肌的肌纤维特性后发现,两组的肌纤维密度无显著性差异,但乳酸菌组具有较高的Ⅰ型肌纤维的数量比例和面积比例,这表明日粮添加乳酸菌有增加Ⅰ型肌纤维的数量比例和面积比例的趋势。

2.2 日粮添加乳酸菌对苏尼特羊肌球蛋白重链表达量的影响

苏尼特羊背最长肌MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx的基因表达量结果如图5所示。

图5 苏尼特羊MyHCs基因的表达量Fig.5 Expression of MyHCs gene of Sunit sheep

根据肌球蛋白重链(MyHCs)的多态性,肌纤维可以分为Ⅰ型(慢速氧化型)、Ⅱa型(快速氧化型)、Ⅱb型(快速酵解型)和Ⅱx型(中间型)[18]。由图5可知,乳酸菌组MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡx的基因表达量均高于对照组,且差异显著(P<0.05)。而MyHCⅡb的基因表达量在两组间没有显著性差异。可见,苏尼特羊MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡx基因表达量受乳酸菌的影响较大。李敏华[19]通过研究微生态制剂对肥育猪肌纤维类型的影响后发现,乳酸菌具有提高肥育猪股二头肌中MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡx的基因表达量的趋势,与本实验结果一致。

2.3 日粮添加乳酸菌对代谢酶活性的影响

由图6可知,与对照组相比,日粮中添加乳酸菌显著降低了苏尼特羊背最长肌中LDH的活性(P<0.05),提高了MDH和SDH的活性(P>0.05)。这说明乳酸菌可以显著降低苏尼特羊宰后的糖酵解程度,提高肌肉的有氧代谢程度。方程[20]研究表明,MDH、SDH酶活性主要与氧化型肌纤维中的Ⅰ型肌纤维的数量比例成正相关。研究结果表明,LDH酶活性与ⅡB型肌纤维数量比例成正相关[21-22]。MDH和SDH均为有氧代谢途径关键酶,其活性的升高说明乳酸菌使肌肉细胞有氧代谢程度增强,也间接证明了氧化型肌纤维含量升高。而LDH是糖酵解途径关键酶,其活性的降低说明肌肉细胞无氧酵解程度降低,也说明了酵解型肌纤维含量的降低。

图6 苏尼特羊代谢酶活性Fig.6 Metabolic enzyme activity of Sunit sheep

2.4 日粮添加乳酸菌对肉品质的影响

由表2可知,与对照组相比,乳酸菌组的pH0、pH24、L*值、剪切力显著降低(P<0.05),a*值显著升高(P<0.05),而b*值和蒸煮损失在两组间无显著性差异。日粮添加乳酸菌显著降低了pH0和pH24,该结果与胡新旭等[23]的研究结果相反,具体原因还有待进一步的研究。宰后肌肉中pH的降低主要是因为肌肉中的糖原经糖酵解过程转化成乳酸积累在肌肉中,因此肌肉中的糖原含量会在很大程度上影响pH的下降程度。日粮添加乳酸菌具有降低ΔpH的趋势(P>0.05),这可能是由于乳酸菌组的Ⅰ型肌纤维的数量比例显著升高,而Ⅰ型肌纤维的糖原含量低于其他类型的肌纤维,因此当Ⅰ型肌纤维所占比例升高时,在一定程度上能减少肌肉中糖原含量,使糖原经糖酵解途径生成乳酸的速率降低,从而延缓宰后pH的下降速率。韦良开等[24]的研究表明,日粮添加0.2%德氏乳杆菌可以显著降低猪宰后45 min的b*值和宰后24 h的L*值。李菊等[25]研究发现,在肉鸡日粮中添加0.5%的乳酸菌发酵液可降低肌肉剪切力,该结果说明乳酸菌能有效改善肌肉嫩度,对于增加肉的感官品质具有重要作用。此外,前文提到日粮添加乳酸菌增加了肌纤维密度,而普遍的研究认为,肌纤维密度越大,肉质越嫩[26]。可见,日粮添加乳酸菌可以明显改善肉品质,相比每只羊每天额外增加的不足一元的成本,乳酸菌的使用将为牧民和企业带来巨大的经济效益。

表2 苏尼特羊背最长肌肌肉品质Table 2 Meat quality traits in longissimus dorsi of Sunit sheep

2.5 相关性分析

由表3可知,pH0与MyHCⅡx基因表达量成极显著负相关(P<0.01),pH24与Ⅰ型肌纤维的数量比例和面积比例成显著负相关(P<0.05)。与对照组相比,乳酸菌组的pH24显著降低,这可能是因为乳酸菌组的Ⅰ型肌纤维的数量比例和面积比例较高,且两者之间的负相关关系恰好验证了这一点。色泽也是评价肉品质的另一项重要指标。L*值与MyHCⅠ基因表达量成显著负相关(P<0.05),a*值与Ⅰ型肌纤维的数量比例、MyHCⅡx基因表达量成显著正相关(P<0.05)。Ryu等[27]研究同样发现,Ⅰ型和ⅡA型肌纤维与肉的色泽成正相关,而ⅡB型肌纤维则与其成负相关。这正是因为氧化型肌纤维所含肌红蛋白和血红蛋白的含量高,因此,当肌肉中氧化型肌纤维所占比例较高时,肌肉颜色鲜红,肉色评分较高。肌纤维特性亦与肌肉嫩度密切相关。Hwang等[10]对韩国本土牛的肌纤维特性与肉质性状间的关系进行研究后发现,牛肉的剪切力与ⅡB型肌纤维的面积比例成正比,与Ⅰ型肌纤维的面积比例成反比。本研究结果显示,剪切力与Ⅰ型、ⅡA型肌纤维的数量比例、面积比例,与MyHCⅠ、MyHCⅡa基因表达量成负相关(P>0.05)。这可能是因为Ⅰ型肌纤维含有较多的中性脂肪,使得肌肉的肌内脂肪增加,从而导致剪切力降低,嫩度升高[28]。此外,Ⅰ型和ⅡA型肌纤维的直径较小,而大量研究已经表明,肌纤维直径与剪切力成正相关,这也再次证明乳酸菌通过提高Ⅰ型和ⅡA型肌纤维的数量,使肌肉的整体肌纤维直径变小,从而改善肌肉嫩度。肌肉系水力也与肌纤维类型有直接关系,高含量的酵解型肌纤维会导致肌肉系水力的下降[29]。同理,氧化型肌纤维所占比例较高有利于提高肌肉的系水力,这与本实验结果一致,即蒸煮损失与Ⅰ型和ⅡA型肌纤维的数量比例成负相关(P>0.05)。综上所述,氧化型肌纤维中肌红蛋白含量高,糖原含量和ATP酶活性较低,肌纤维直径较小,厌氧酶含量低,有氧代谢能力强,因此,氧化型肌纤维所占比例较高时,肌肉的色泽、pH较好,肌肉细嫩,肉质好[30]。

表3 肌纤维特性、MyHCs基因表达量与肉品质的相关性Table 3 Correlation between muscle fiber characteristics,MyHCs gene expression and meat quality

3 结论

通过在日粮中添加乳酸菌可以提高苏尼特羊背最长肌中氧化型肌纤维(Ⅰ型、ⅡA/Ⅱa型)的数量比例,降低LDH酶活性,使L*值、剪切力降低,a*值升高,这说明日粮添加乳酸菌可以减缓宰后肌肉pH下降,改善肌肉色泽、嫩度。通过相关性分析发现,pH0与MyHCⅡx基因表达量成极显著负相关,pH24与Ⅰ型肌纤维的数量比例和面积比例成显著负相关。L*值与MyHCⅠ基因表达量成显著负相关,a*值与Ⅰ型肌纤维的数量比例、MyHCⅡx基因表达量成显著正相关。这说明氧化型肌纤维比例高对提高肉品质有促进作用,而本实验得出乳酸菌可以提高氧化型肌纤维的数量比例,由此可知,日粮添加乳酸菌会影响肌纤维类型,进而影响肉质。因此,在未来畜牧业,可以将乳酸菌作为饲料添加剂应用于日粮中,从而提高羊肉品质。