葡萄糖酸锌口服溶液中5-羟甲基糠醛限量检查

李 玲，王秋实

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222006）

5-羟甲基糠醛（5-HMF）是葡萄糖、果糖等单糖在高温、酸性条件或微生物的作用下脱水生成的醛类化合物，对人体横纹肌和内脏有损害，具有神经毒性，能与人体蛋白质结合产生蓄积中毒[1-2]，还有遗传毒性、致癌性和致突变性[3]。葡萄糖酸锌口服溶液适用于小儿厌食症、皮肤痤疮、口腔溃疡、儿童生长发育迟缓等缺锌性疾病，其质量标准收载于2015年版《中国药典（二部）》[4]1276，但并未对杂质进行控制。葡萄糖酸锌合成的起始原料主要为葡萄糖，且口服溶液辅料中含有较多蔗糖，特别在高温灭菌过程中[5]，极易产生糖的降解产物5-HMF。2015年版《中国药典(二部)》对以葡萄糖为载体的注射液均进行 5-HMF 的控制[4]215，380，489，1290，且 2015 年版《中国药典(一部)》对药用蜂蜜进行了5-HMF的控制[6]。本研究中采用高效液相色谱(HPLC)法对葡萄糖酸锌口服溶液中杂质5-HMF进行限量检查，为提高本品质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695型HPLC仪，包括2998PDA检测器，Empower色谱工作站(美国Waters有限公司）；SartoriusBP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

5-HMF对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111626-201610，纯度为 99.2%）；葡萄糖酸锌口服溶液（厂家和批号见表1，规格为0.35%）；乙腈和甲酸均为色谱纯；水为超纯水。

表1 8批葡萄糖酸锌口服溶液的厂家及批号

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.1% 甲酸（8 ∶92，V／V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：284 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

取5-HMF对照品10.12 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加水振摇使溶解，稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液。取本品5 mL，精密称定，置10 mL容量瓶中，加水振摇使溶解，稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 专属性试验

量取上述空白溶剂、对照品溶液与供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按拟订色谱条件进样测定。结果溶剂不干扰测定，5-HMF与相邻杂质均能完全分离，专属性良好，理论板数按5-HMF峰计不低于3 000。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.4 破坏性试验

量取样品（批号为20180904）5 mL，共5份，分别进行酸破坏（加 0.2 mol／L 盐酸溶液 2 mL，室温放置 4 h，加0.2 mol／L氢氧化钠溶液2 mL中和，用水定容至10 mL），碱破坏（加 0.2 mol／L氢氧化钠溶液 2 mL，室温放置4 h，加 0.2 mol／L 盐酸溶液 2 mL 中和，用水定容至10 mL），氧化破坏（加3%过氧化氢溶液5 mL，室温放置 4 h），光照破坏（置 4 500 lx，24 h，定容至 10 mL），高温加热（90℃水浴4 h，放冷至室温，定容至10 mL）。分别取上述破坏溶液20 μL，进样测定，结果5-HMF色谱峰与上述破坏样品中相邻成分峰分离良好，破坏样品中产生的杂质对5-HMF的测定无干扰。其中，5-HMF在碱和光照破坏条件下降解严重，稳定性差；在氧化条件下略有降解；在酸破坏条件下稳定性良好，基本无降解。结果见图2。

图2 破坏性试验高效液相色谱图

2.5 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取2.2项下对照品贮备液各适量，用水稀释成质量浓度分别为 0.2，1，4，10，20，40 μg／mL的系列线性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，以对照品质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y＝144 134 X-23 253，r＝0.999 8(n＝6)。结果表明，5-HMF 质量浓度在0.202～40.480 μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

稳定性试验：取供试品溶液（批号为20180904），分别于 0，2，8，12，18，24 h 时进样测定，记录色谱图。结果5-HMF峰面积的 RSD为 1.16%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

精密度试验：取对照品溶液，连续进样6次，测定5-HMF 峰面积。结果的 RSD 为 0.69% （n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批样品（批号为20180904）6份，按2.2项下方法平行制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果 5-HMF 含量平均值为 30.6 μg／mL，RSD为0.86%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为20180904）9份，精密量取 5 mL，分别置 20 mL容量瓶中，平均分成3组，分别精密加入对照品贮备液1，1.5，2 mL，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，计算加样回收率。结果见表2。

表2 5-HMF加样回收试验结果（n＝9）

检测限和定量限确定：精密量取5-HMF对照品溶液适量，加水逐步稀释，进样，根据信噪比（S／N）为3和10分别确定检测限和定量限，结果检测限和定量限分别为 1.0 ng 和 4.0 ng。

2.6 样品含量测定

取 8 批(批号分别为 20190406，20180904，181113，180950，18120833，181104，20181206，180906)样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，精密吸取20 μL，按拟订色谱条件进行测定，并按外标法计算含量。结果前7批样 品 中 5-HMF 分 别 为 1.95，30.56，39.14，39.25，0.70，3.77，41.46 μg／mL，仅批号为 180906 的样品中未检出。

3 讨论

3.1 提取方法选择

5-HMF易溶于甲醇、乙醇和水，曾比较甲醇、50%甲醇和水作为提取溶剂的差异，结果3种溶剂均能达到充分提取的效果。考虑到成本及安全问题，结果选择水作为提取溶剂，且杂质较少。同时，考察超声时间（0，5，10 min）对提取效率的影响，结果制备供试品溶液不需要超声，适当振摇即可提取完全。

3.2 检测结果分析

共收集销售较好的6个厂家共8批次的样品，试验结果表明，8批样品中 5-HMF 含量在 0.70～41.46 μg／mL 范围，其中有1批未检出5-HMF，最高质量浓度与最低质量浓度相差近60倍。可见，目前市售葡萄糖酸锌口服溶液质量参差不齐，部分厂家在生产工艺、储存、质量控制等方面仍不完善。为保证成品质量，应重点考察工艺合理性，制订规范化的生产过程及合理的质量控制指标。

3.3 应用价值

葡萄糖酸锌口服溶液儿童及成人的口服剂量范围为 10～40 mL／d，其中 5-HMF的质量浓度范围为0.70 ～ 41.46 μg／mL，日暴露量则为 7.0 μg ～1.66 mg。对比以下 3种情况：1）2015年版《中国药典（二部）》对葡萄糖注射液、以葡萄糖为载体的注射液均规定了5-HMF的限量，经折算，日最大暴露量分别为1.75 mg（临床常用规格为5%）和5 mg[3]，本试验中样品中5-HMF含量均在允许范围内；2）2015年版《中国药典（一部）》对蜂蜜规定了5-HMF的限量，经折算，日最大暴露量为1.2 mg[3]，本研究中有4批样品均超过日最大暴露量限度；3)5-HMF属2类遗传毒性杂质，限度的制订需按遗传毒性杂质要求进行，最理想的限度是5-HMF的日暴露量为1.5 μg[3]，本试验中有7批样品中5-HMF的含量远超过毒理学阈值（TTC）限度的要求，存在安全隐患，但TTC是一个高度保守的暴露量，控制指标过于严格会导致生产成本增加和生产工艺的难度。由于葡萄糖酸锌口服溶液属口服制剂，故参考蜂蜜的5-HMF日最大暴露量来制订本品的质控限度，经折算，将毒性杂质5-HMF限度定为应不得过30 μg／mL。建议本品质量标准增加5-HMF检查项，建议部分厂家完善生产工艺，提高产品质量，以保证临床用药安全性。葡萄糖酸锌口服溶液临床广泛应用于儿童，故控制遗传毒性杂质5-HMF的限量具有重要临床意义。