淫羊藿苷调节大鼠脑内N-甲基-D-天冬氨酸受体分子机制研究

陈 静，高 瑜，夏海建，黄富宏，王蓓蓓

（扬州大学附属医院药剂科，江苏 扬州 225001）

精神分裂症是由一组症状群所组成的临床综合征，其破坏性严重[1]。中枢神经系统谷氨酸，尤其是N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）系统功能低下是精神分裂症的病因之一[2]。淫羊藿为小檗科植物淫羊藿的全草，是一种补益中药。淫羊藿苷是其主要活性成分，可改善NMDA系统功能低下的精神分裂症动物的异常行为[3]。但淫羊藿苷调节NMDA系统的分子机制未见报道。脑源性神经营养因子（BDNF）是由BDNF基因编码在脑内合成的一种具有神经营养作用的蛋白质，广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用。BDNF基因也是精神分裂症致病基因之一，主要表现精神分裂症患者体内BDNF的表达发生异常[4-6]。以淫羊藿为主药的中药方剂可治疗精神分裂症，并调节海马体内BDNF的表达[7-10]。同时，淫羊藿苷对中枢神经中BDNF mRNA的表达具有调节作用[11]。BDNF可通过自分泌，与细胞膜上的TrkB受体结合，并激活TrkB受体。激活的TrkB受体可活化下游蛋白磷脂酶 Cγ（PLCγ）[12]；激活的 PLCγ使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解产生二酰甘油（DAG），DAG 进一步激活蛋白激酶 Cδ（PKCδ）；PKCδ 通过活化 Ras蛋白激活Raf-1，进一步激活其下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPKK或MEK）及胞外调节蛋白激酶（ERK）。而ERK的激活可上调NMDA受体NR1亚基的活性[13]。本研究中应用NMDA受体拮抗剂MK-801构建精神分裂症动物模型[14]，探讨了淫羊藿苷对BDNF／TrkB介导的PKC／Raf-1／ERK信号通路的调节作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：CM1950型冰冻切片机（德国 Leica Biosystems公司）。

试药：MK-801（M107），5% 小牛血清蛋白（BSA，批号为 B2064），利培酮(批号为 PHR1631)，均购自美国Sigma-Aldrich 公司；anti-BDNF（批号为 ab108319），anti-TrkB（批 号 为 ab18987），anti-Raf-1（批 号 为ab137435），anti-NMDA NR1（批号为 ab109182），均购自英国 Abcam 公司；anti-PKCδ（批号为＃2058），Anti-ERK1 ／2（批号为＃4696），β -actin（批号为＃3700，1 ∶5 000），均购自美国 Cell Signal公司；NP40 裂解液（碧云天生物技术公司，批号为P0013F）；SDS-PAGE电泳凝胶（批号为 1656020），PVDF 膜（批号为 1620177），均购自美国Bio-Rad公司；淫羊藿苷（南京本草益康生物科技有限公司）[11]。

动物：SPF级健康雄性SD大鼠24只，4周龄，体质量90～110 g，购自南京青龙山动物养殖中心，实验动物使用许可证号为SYXK（苏）2017-0044，动物实验证书编号为2150541。

1.2 方法

精神分裂症模型的构建：采用MK-801制备精神分裂症动物模型。选取大鼠24只，清洁饲养，饲养环境温度控制在 21～24℃，12 h 昼夜节律（8：00～20：00），自由进食和饮水。将MK-801溶于生理盐水中，腹腔注射，每日1次，剂量为0.2 mg／kg；空白对照组注射生理盐水；所有动物接受连续2周的MK-801或生理盐水注射。

实验分组与给药：MK-801处理后，动物行为异常（尤其是认知障碍和空间记忆障碍）可持续数周至数月[15]，故MK-801动物模型构建完成后，对大鼠使用药物。将MK-801处理的大鼠随机分为模型组、药物组（淫羊藿苷组）和阳性对照组（利培酮组），每组6只。将相应药物混入糖丸（含玉米粉40%、白砂糖40%、全脂奶粉18%、明胶2%），喂饲大鼠，1日3次，每8 h 1次。对照组喂饲不含药物的糖丸；模型组喂饲不含药物的糖丸；药物组喂饲含淫羊藿苷[30 mg／(kg·d）][11]的糖丸；阳性对照组喂饲含利培酮[0.3 mg／(kg·d）]的糖丸。连续喂饲1周。

蛋白质印迹(WB)法检测蛋白质的表达：采用冰冻切片法切取大鼠海马体组织，在冰冻切片机上切成500 μm厚度的切片，再对照脑图谱[16]切取海马体。加入含蛋白酶抑制剂的NP40裂解液匀浆脑组织。匀浆后的组织加热变性，以每孔 10 μg蛋白上样，进行 SDSPAGE电泳，电泳结束后转至PVDF膜上，5%小牛血清蛋白（BSA）于室温封闭1 h。再加入相应抗体，于4℃孵育，过夜。采用Bio-Rad Image Lab软件进行灰度分析，所有实验重复3次，以确保重复性。

1.3 统计学处理

实验数据采用 X±SE表示，采用 SPSS 25.0统计学软件进行分析，利用Kolmogorov-Smirnov Z-test检测数据呈正态分布。若数据呈正态分布，则利用单因素方差分析（One-way ANOVA）及 Dunnett t检验比较组间差异；若数据不呈正态分布，则使用Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whiney U检验比较组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对海马体中NMDA NR1亚体表达的调节作用

结果见图1。MK-801模型组中，NMDA NR1亚体的表达水平显著下降（P＜0.01）；药物处理后，与模型组相比，MK-801导致的NMDA NR1亚体的表达水平显著上升（P＜0.05），使其恢复至正常水平，且其效果接近利培酮（P ＜0.05）。

图1 淫羊藿苷对NMDA受体NR1亚基表达水平的调节作用

2.2 对海马体中BDNF表达的调节作用

结果见图2。MK-801处理2周后可显著降低海马体中 BDNF的表达水平（P＜0.01）；与模型组相比，药物处理后淫羊藿苷可显著提升被MK-801下调的BDNF的表达水平（P＜0.05），使其恢复至接近正常水平，其效果与利培酮相似。

2.3 对海马体中TrkB受体表达的调节作用

TrkB受体是BDNF的主要作用受体。由图3可见，TrkB受体的表达水平在MK-801处理2周后显著下降（P＜0.01）。与模型组相比，药物处理后，淫羊藿苷可显著提升被MK-801下调的TrkB受体的表达水平（P＜0.05），使其恢复至接近接近正常水平，其效果与利培酮相似。

2.4 对海马体中PKC表达的调节作用

结果见图4。MK-801可显著下调PKC的表达水平（P＜0.01）。与模型组相比，药物处理后，淫羊藿苷可显著上调被MK-801下调的PKC表达水平（P＜0.05），其效果与利培酮相似。

图2 淫羊藿苷对BDNF表达水平的调节作用

图3 淫羊藿苷对TrkB受体表达水平的调节作用

2.5 对海马体中Raf-1表达的调节作用

结果见图5。MK-801可显著下调Raf-1的表达水平（P＜0.01）。与模型组相比，药物处理后，淫羊藿苷虽上调了Raf-1的表达水平，但差异无统计学意义（P＝0.068）；而利培酮可显著提升Raf-1的表达水平（P＜0.05）。

2.6 对海马体中ERK1／2表达的调节作用

结果见图6。可见，MK-801可显著下调ERK的表达水平（P＜0.01）。药物处理后，与模型组相比，药物组的ERK表达水平显著上升（P＜0.05），使其恢复至接近正常水平，其效果与利培酮相似。

图4 淫羊藿苷对PKC表达水平的调节作用

图5 淫羊藿苷对Raf-1表达水平的调节作用

3 讨论

谷氨酸受体功能低下被认为是精神分裂症的发病机制之一。MK-801作为NMDA受体的非竞争性拮抗剂，能通过降低脑内NMDA受体功能引起类似精神分裂症的症状，在啮齿类动物中引起一系列复杂的行为学改变，常作为筛选抗精神分裂症潜在药物的经典动物模型[2]。本研究中应用MK-801腹腔给药处理未成年大鼠，阻断其脑内NMDA受体，从而破坏大鼠脑部NMDA系统的发育，致使动物成年后出现NMDA受体功能低下导致的相关症状，如认知障碍和空间记忆障碍[14]。本研究结果显示，淫羊藿苷可上调海马体中NMDA受体NR1亚体的表达水平，从分子层面证实淫羊藿苷可增强NMDA受体的功能。

抗精神病药物可通过BDNF介导的通路调节NMDA受体的功能。TrkB受体是BDNF的主要功能受体，表达在细胞膜上，BDNF可通过自分泌，与TrkB受体结合并使其活化，而PKC，Raf-1，ERK是TrkB受体下游信号通路之一，其蛋白表达水平与TrkB受体表达相关。

图6 淫羊藿苷对ERK1／2表达水平的调节作用

本研究结果显示，淫羊藿苷可上调被MK-801抑制的TrkB受体的表达水平，可能是由于其上调了BDNF的表达，致使TrkB受体的表达水平上升；可改善被MK-801下调的BDNF的表达水平，其很有可能通过BDNF介导的通路调节NMDA受体功能；PKC，Raf-1，ERK的表达水平均受到抑制，但淫羊藿苷可显著提升这些蛋白的表达水平。结果显示，淫羊藿苷很有可能通过激活BDNF／TrkB介导PKC／Raf-1／ERK信号通路增进NMDA受体的功能，进而治疗NMDA受体功能低下导致的精神分裂症。

本研究中，采用抗精神病药物利培酮作为阳性对照。结果显示，淫羊藿苷的疗效接近利培酮，且调节NMDA受体的分子机制与利培酮相似，提示其在精神分裂症治疗领域具有良好的应用前景。现有抗精神病药物都具有毒副作用（如锥体外系反应），也未见患者长期使用淫羊藿苷有明显的毒副作用；相反，淫羊藿苷和现有抗精神病药物联用可改善患者的生活质量[7]，故淫羊藿苷很有可能成为现有抗精神病药物的优良替代品，但仍需进一步探索淫羊藿苷对多种不同精神分裂症的治疗效果。但由于本研究属中短期实验，淫羊藿苷的毒副作用可能尚未表现出来，后续研究中应对比现有抗精神病药物，系统研究长期使用淫羊藿苷可能引起的毒副作用；且淫羊藿苷是否还通过其他信号通路调节NMDA受体也有待进一步研究。