盐酸戊乙奎醚诱导早期生长反应蛋白1的表达及其对人血管平滑肌细胞的增殖作用

陈 曦，胡婷婷，史惠卿，刘小娟，李 楠

（中国人民解放军西部战区总医院，四川 成都 610083）

早期生长反应蛋白 1（EGR1）属即刻早期基因家族、编码cys2-his2型锌指蛋白，广泛表达于从酵母到人类的真核细胞中[1]。作为转录因子的EGR1，能与多种下游基因的启动子区域相结合，调控许多基因的表达，这些基因参与细胞增殖、分化、凋亡、缺氧反应等生物学效应[2-3]，有的甚至在肿瘤中发挥重要作用[4-5]。EGR1是表皮生长因子受体（EGFR）介导的脑室区神经干细胞和祖细胞在缺氧-低血糖恢复期扩增的关键调节因子[6]。DICKINSON等[7]的研究显示，EGR1能促进血管表皮细胞的增殖，但EGR1通过何种基因影响细胞的增殖仍有待进一步研究。本研究中探讨了EGR1在人类血管平滑肌细胞(CRL-1999)增殖过程中的作用及影响的下游基因，旨在揭示其在肺血管损伤修复中的作用提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器

细胞株：CRL-1999购于ATCC。

试剂：F-12K营养混合物培养基，胎牛血清，均购自Gibco公司；抗人EGR1抗体（Santa公司）；抗人细胞周期调控蛋白D1（CCND1）抗体，抗人细胞外信号调节激酶 1／2（ERK1／2）抗体，抗人磷酸化的 ERK1／2（p-ERK1／2）抗体，均购自 CST公司；辣根氧化酶标记的山羊抗兔，山羊抗鼠二抗，均购自博奥生物公司）；RIPA裂解液；二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒，5% ～20%梯度预制胶，电泳液，转膜液及蛋白彩色预染MARKER、ECL化学发光试剂盒，均购自碧云天公司；逆转录试剂盒，实时荧光定量聚合酶链式反应（qRTPCR）试剂盒，均购自日本Takara公司；慢病毒购自吉凯生物公司；EDU检测试剂盒（iClickTM EdU Andy Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit，广东复能基因有限公司)。

仪器：7500型 Real-Time PCR System PCR仪（美国ABI公司）；Fluor Chem型凝胶成像化学发光系统（美国Protein Simple公司）；Gallios型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.2 方法

细胞培养：取CRL-1999细胞，置含10%胎牛血清的F-12K营养混合物培养基于37℃、5%CO2培养箱中培养。

细胞慢病毒干扰实验：取10×104个／孔对数期生长的细胞，置12孔板中，过夜贴壁培养。按感染复数(MOI)为30的量加入慢病毒，培养12 h后，换成新鲜的培养基继续培养36 h，然后在荧光显微镜下观察转染效率。

qRT-PCR：采用Trizol法分别提取siEGR1-CRL-1999细胞和对照细胞总RNA，用逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA，用SYBR PCR试剂盒在7500型Real-Time PCR System RCR仪上进行qRT-PCR检测（预变性，95 ℃ 30 s，然后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 个循环），设置 3个复孔。PCR引物：ACTIN，正向引物 5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，反向引物 5′-GTAGTTTC GTGGATGCCACAG-3′；EGR1，正向引物 5′-CAGCAC CTTCAACCCTCAG-3′，反向引物 5′-CACAAGGTGTT GCCACTGTT-3′；CCND1，正向引物 5′-TATTGCGCTGCTACCGTTGA-3′，反向引物 5′-CCAATAGCAGCAA ACAATGTGAAA-3′。

蛋白质印迹（WB）法检测 EGR1，CCND1，ERK1 ／2和p-ERK1／2蛋白表达：采用RIPA裂解液法提取细胞总蛋白，采用BCA法测蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后，沸水煮5 min使蛋白变性；蛋白上样量为40 μg，以5%～20% 梯度胶电泳分离蛋白质；湿转法转移蛋白至聚偏乙烯（PVDF）膜，5%BSA封闭1 h，加入一抗4℃过夜（EGR1 1 ∶1 000，ACTIN 1 ∶2 000，CCND1 1 ∶1 000，ERK1 ／2 1 ∶1 000，p-ERK1 ／2 1 ∶1 000），二抗室温孵育 1 h（山羊抗鼠 1∶5 000，山羊抗兔 1∶5 000），采用ECL化学发光法显示结果。

EDU法检测细胞增殖：分别用胰酶消化对照组细胞和 siEGR1-CRL-1999细胞，计数，2×105个 ／孔接种于6孔板内，37℃过夜培养，弃培养基，每孔加入2 mL含 10 μmol／mL EDU 的培养液，37 ℃，CO2培养箱中继续培养6 h，按试剂盒说明处理细胞，采用流式细胞仪分析。

盐酸戊乙奎醚处理细胞：将CRL-1999细胞和siEGR1-CRL-1999细胞按 5×105个／孔接种于 6孔板中，培养过夜，然后加入盐酸戊乙奎醚，并设空白对照组，最终质量浓度为2 μg／mL。放入培养箱中培养，并于0，0.5，1，2，4，8 h 时取材备用。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件分析。计量资料（正态分布）以±s表示，组内两两比较行 t检验；采用相关性分析采用Pearson相关分析，r＜0.3为低度正相关，0.3≤r＜0.7 为中度正相关，0.7≤ r＜ 1.0 为高度正相关；统计图表采用GraphPad Prism 6绘制。P＜0.01为差异有显著统计学意义，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒对CRL-1999细胞中EGR1表达水平的影响

细胞转染EGR1干扰慢病毒48 h后，荧光显微镜下观察发现，大部分细胞都表现出明显的绿色荧光（见图1 A），表明细胞转染了慢病毒，并整合到基因组上，成功构建siEGR1-CRL-1999细胞。qRT-PCR结果显示，EGR1被成功干扰（见图 1 B，P ＜0.01）。同时，WB 实验结果表明，EGR1蛋白表达水平也明显降低（见图1 C）。

图1 慢病毒对CRL-1999细胞中EGR1表达水平的影响

2.2 敲低EGR1表达对CRL-1999细胞增殖的影响

将EDU加入siEGR1-CRL-1999细胞或对照组细胞中，培养6 h后，阴性对照组中26%的细胞含有EDU，即26%的细胞进入了S期；同时，siEGR1-CRL-1999细胞中只有19%的细胞含有EDU，其增殖效率减少了 27% （见图 2，P ＜ 0.01）。表明干扰 EGR1 后，CRL-1999细胞增殖受到了明显抑制。

图2 敲低EGR1表达对CRL-1999细胞增殖的影响

2.3 敲低EGR1表达对CCND1表达水平的影响

敲低 EGR1后，qRT-PCR结果表明，CCND1的表达相应降低（见图 3A，***P ＝0.0003，**P ＝0.001 1）。WB实验也表明，敲低CRL-1999细胞的EGR1后，CCND1蛋白表达水平明显降低（见图3 B）。

图3 敲低EGR1表达对CCND1表达水平的影响

2.4 盐酸戊乙奎醚对EGR1表达水平的影响

对CRL-1999细胞进行盐酸戊乙奎醚处理，分别在 0 h（处理前），及处理后 0.5，1，2，4，8 h 时提取蛋白质，进行WB检测，发现处理1 h后EGR1蛋白表达开始增多，2 h时达顶点，一直持续到8 h时（见图4 A），表明盐酸戊乙奎醚能诱导CRL-1999细胞的EGR1表达。为了进一步验证，对siEGR1-CRL-1999细胞和CRL-1999细胞同时进行盐酸戊乙奎醚处理，并进行WB检测。处理4 h后，盐酸戊乙奎醚处理组的CRL-1999细胞和 siEGR1-CRL-1999 细胞的（b，d）EGR1 蛋白表达量均比未处理组（a，c）增多，且药物诱导后的siEGR1-CRL-1999细胞（d）的EGR1蛋白表达量显著低于CRL-1999细胞（b），进一步表明盐酸戊乙奎醚能诱导CRL-1999细胞的EGR1表达（见图4 B）。

图4 盐酸戊乙奎醚对EGR1表达水平的影响

2.5 盐酸戊乙奎醚可通过ERK1／2通路刺激EGR1表达

对2.4项下不同时间点提取的蛋白质中p-ERK1／2，ERK1／2和EGR1蛋白的表达水平进行检测，结果显示，p-ERK1／2在盐酸戊乙奎醚处理1 h后表达水平达峰值，维持至2 h时，随后逐渐减少。而EGR1的表达在1 h时仅轻微增多，后逐渐增多，其蛋白水平表达变化在时间上总落后于 p-ERK1／2（见图5），提示盐酸戊乙奎醚可通过ERK1／2通路诱导EGR1的表达。

图5 加入盐酸戊乙奎醚后，不同时间点p-ERK1／2，EGR1蛋白表达水平

3 讨论

通常血管平滑肌细胞在动脉中膜中维持非增殖状态，但在损伤或其他刺激下，中膜的血管平滑肌细胞会迁移到内膜，开始增殖并分泌细胞外基质，导致动脉内膜扩张，即新内膜形成[8]。富含丝／精氨酸剪辑因子1（SRSF1）能通过 Δ133p53-EGR1复合体，影响KLF5的表达，从而促进血管平滑肌细胞的增殖[9]。XIE等[10]的研究发现，EGR-1参与了瘦素诱导的过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）的减少和肺动脉平滑肌细胞的增殖。SYSOL等[11]的研究发现，血小板源生长因子（PDGF）通过 EGR-1 诱导鞘氨醇激酶 1（SphK1）的表达，可促进肺动脉平滑肌细胞增殖。此外，在其他组织中，EGR1也起到了促进细胞增殖的作用，如肌肉衍生的卫星细胞[12]、小鼠肝脏细胞[13]等。EGR1除了能被生长因子诱导高表达外，也能被一些刺激诱导高表达，如缺氧、辐照等；缺氧情况下，会对肺动脉造成一定程度损伤，故进一步研究EGR1的功能，不但能在损伤修复阶段起作用，而且在损伤防治阶段也能起到一定作用。

阿魏酸通过缺氧上调EGR1来改善人肌腱衍生干细胞的自我更新和分化[14]。CHEN等[15]的研究结果证实，CCND1的转录是由EGR1直接调控的，CCND1是3种非连接蛋白（Cyclin D1，D2，D3）之一，在哺乳动物细胞周期中主要调控G1期向S期过渡。敲低CRL-1999细胞的EGR1后，会影响CCND1的表达，从而影响人血管平滑肌细胞CRL-1999的体外增殖。

盐酸戊乙奎醚是我国自主研发的抗胆碱Ⅰ类新药，有较强的抗M和N样受体作用，对外周神经有较强的抗M样作用和一定程度的抗N样作用，临床主要用于对抗有机磷的中毒和全身麻醉患者术前给药。盐酸戊乙奎醚能较早改善氧合，减缓急性肺损伤的进展，可应用于对创伤性急性肺损伤早期的干预治疗[16]。盐酸戊乙奎醚能抑制炎性反应，减轻肺组织的损伤，改善氧合，能有效缓解多发伤导致的急性肺损伤[17]，但其具体作用机制和通路仍不清楚。ZHANG等[18]的研究认为，在缺血再灌注诱导的急性肺损伤中，通过适当增加自噬可起到保护作用，同时 ERK1／2信号通路具有积极的调节作用。ERK1／2是20世纪80年代末期发现的一类丝／苏氨酸蛋白激酶，是MAPK家族的一个重要亚族，正常定位于胞浆，当激活后转位至胞核，调节转录因子活性，产生细胞效应。本研究中发现盐酸戊乙奎醚能通过ERK1／2通路刺激EGR1的表达，但盐酸戊乙奎醚通过EGR1影响血管平滑肌细胞的具体作用机制仍不清楚，有待进一步研究。