高效液相色谱-蒸发光散射检测器法同时测定化瘀祛斑胶囊中4种柴胡皂苷含量

王丽方 ，刘 炜

（1.首都医科大学附属北京世纪坛医院药剂科，北京 100038； 2.临床合理用药生物特征谱学评价北京市重点实验室，北京 100038； 3.临床合理用药生物特征谱学评价国际合作联合实验室，北京 100038）

化瘀祛斑胶囊质量标准收录于2015年版《中国药典（一部）》，其由柴胡、薄荷、黄芩、当归、红花、赤芍 6味药材经过提取精制而成，具有疏风清热、活血化瘀的功效，主要用于风热瘀阻产生的黄褐斑、酒 等症状[1-3]。方中柴胡疏散退热、疏肝解郁、升举阳气，为君药，且与该药的药理作用一致，柴胡皂苷为柴胡疏风散热、解郁的主要有效成分[4-7]。目前，柴胡的质量控制标准仅有薄层色谱鉴别，而无定量控制。2015年版《中国药典(一部)》柴胡药材项下以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d为指标成分进行含量控制，但两者均不稳定，在煎煮和制剂过程中均易分解，分别产生柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2，且其次生皂苷也具有较好的生物活性[8-10]。目前，关于化瘀祛斑胶囊的研究主要集中在临床研究[11-12]、黄芩苷含量测定[13-14]及多组分的含量测定[15-16]，尚未见柴胡皂苷含量测定报道。参考文献[17]，本研究中以柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2和柴胡皂苷d作为控制化瘀祛斑胶囊中柴胡的指标成分，采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法同时测定4种柴胡皂苷含量，为全面提高化瘀祛斑胶囊的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695型高效液相色谱仪，包括2424ELSD蒸发光散射检测器，Empower3色谱工作站(Waters公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为 300 W，频率为 40 kHz）；XPE204型电子天平（美国梅特勒多利多公司，精度为十万分之一）。

图1 高效液相色谱-蒸发光散射检测器法色谱图

1.2 试药

柴胡皂苷a对照品（批号为110777-201912，含量为 94.8%），柴胡皂苷 d对照品（批号为 110778-201912，含量为96.3%），均购自中国食品药品检定研究院，供含量测定用；柴胡皂苷 b1对照品（批号为DST180519-009，含量为 98.0%），柴胡皂苷 b2对照品（批号为 DST170330-010，含量为 99.0% ），均购自成都曼斯特生物技术有限公司；柴胡药材（陕西兴德中药饮片公司，批号为80301），经首都医科大学王炜主任药师鉴定为伞形料柴胡 Bupleurum Chinese DC.的干燥根（习称北柴胡）；化瘀祛斑胶囊（山西仁源堂药业有限公司，批号分别为 20181002，20181105，20181203，规格为每粒 0.32 g）；氮气（纯度不低于 99.999% ），乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax Bonus-RP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脱，0～18 min时 38%A，18～32 min时 38% ～41%A，32～40min时 41%A，40～56mi时 41% ～52%A，56～59min时52% ～90%A，59～69 min 时 90%A；流速：1.0 mL／min；柱温：30℃；漂移管温度：42℃；载气：氮气，流速：2.5 mL ／min；进样量：10，20 μL。

2.2 溶液制备

取柴胡皂苷a对照品8.02 mg、柴胡皂苷b1对照品8.15 mg、柴胡皂苷 d 对照品 8.88 mg，精密称定，置同一20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液Ⅰ；另取柴胡皂苷b2对照品2.61 mg，精密称定，置5 mL容量瓶中，精密加入上述对照品贮备溶液Ⅰ2 mL，置上述同一5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为5号混合对照品溶液。然后采用逐级稀释法分别制备系列质量浓度的对照品溶液，记为1～4号混合对照品溶液。取样品（批号为20181002）10粒内容物，研匀，取0.5 g，精密称取，置具塞锥形瓶中，精密加入5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，称定质量，超声处理（功率为 240 W，频率为 40 kHz）30 min，取出放凉，加5%浓氨试液的甲醇溶液补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，用 0.45 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取缺柴胡药材的阴性样品，依法制备阴性对照药材溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液，按拟订色谱条件测定，色谱图见图1。结果阴性对照药材溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上未见色谱峰，表明处方中其余药味对4种柴胡皂苷的含量测定无干扰。

线性关系考察：精密吸取上述1～5号混合对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，各进样2次，进样量为20 μL，以峰面积平均值的对数值为纵坐标（Y）、进样量的对数值为横坐标（X）进行线性回归。结果见表1。

表1 4种柴胡皂苷的线性关系考察结果

精密度试验：分别精密吸取上述1，3，5号低、中、高质量浓度的对照品溶液，按拟订色谱条件测定峰面积，各进样6次。结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷 d 的 RSD 分别为 0.36% ，0.42% ，0.23%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为20181002），依法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件测定峰面积，并按照两点对数法计算含量。结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷 b1、柴胡皂苷 d含量的 RSD分别为 0.71%，0.56%，0.38%，0.65%（n＝6）。表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为20181002），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于 0，2，4，8，16，20，24 h时测定峰面积。结果柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷 b1、柴胡皂苷 d的 RSD分别为 1.96%，1.35%，2.01%，2.28%（n ＝6），表明供试品溶液在 24 h 内稳定。

加样回收试验：取柴胡皂苷b15.38 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，作为待加溶液，另分别取柴胡皂苷a 4.62 mg、柴胡皂苷b28.65 mg和柴胡皂苷 d 5.49 mg，精密称定，置同一 10 mL容量瓶中，精密吸取上述柴胡皂苷b1待加溶液2 mL，置上述同一10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为待加对照品的混合溶液。取样品（批号为20181002）0.25 g，共6份，加入上述待加对照品混合溶液1 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表2。

表2 4种柴胡皂苷加样回收试验结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，平行制备3份，按拟订色谱条件进行测定。结果见表3。

3 讨论

3.1 供试品制备方法选择

参考《中国药典(一部)》柴胡项下的含量测定方法，采用 L9（33）正交试验对氨水甲醇的体积分数（3%，5%，7% ）、超声功率（180 W，240 W，300 W）和超声时间（20 min，30 min，40 min）进行预试验。结果表明，超声频率及时间对测定结果无显著性影响，氨水甲醇体积分数对测定结果有显著性影响。综合考虑，选择5%氨水甲醇作为提取溶剂，超声处理(功率为240 W)30 min，为供试品的最佳提取制备工艺。

表3 3批样品中4种柴胡皂苷含量测定结果(mg／g)

3.2 检测器条件选择

预试验中采用紫外检测器测定4种皂苷，由于皂苷类均是末端吸收，干扰峰较多，通过调整流动相和更换不同厂家色谱柱均未能使其分离。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d主要是环氧醚型柴胡皂苷，柴胡皂苷b1和柴胡皂苷b2是异环双烯型柴胡皂苷，含有共轭双烯结构[10]，与柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的最大吸收具有一定差异，前期试验发现其难以分离。由于蒸发光散射检测器是通用质量型检测器，且对皂苷类具有较好的响应。综合考虑，采用蒸发光散射检测器进行测定，同时对蒸发光散射检测器的漂移管温度进行优化。当漂移管温度升高至80℃以上时，峰面积会急剧减小，且峰形不对称、分离度不好，可能是由于温度过高导致样品溶剂挥发时带走部分对照品，影响样品的测定结果。综合考虑，选择漂移管温度为42℃，色谱峰分离良好，峰形良好，无干扰。

3.3 系统适用性考察

曾考察不同流速（0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL ／min）、不同柱温（20，25，30，35，40 ℃）、不同漂移管温度（38，40，42，44，46℃）及 3种不同厂家的色谱柱（Agilent Zorbax Bonus-RP C18柱，Welch Ulitimate XB C18柱，Waters XBridge C18柱），结果显示，在上述色谱条件范围内，样品中4种柴胡皂苷的色谱峰分离良好、理论板数高，对称因子在0.95～1.05之间，且峰形对称。不同厂家色谱柱均能分离4种柴胡皂苷色谱峰，故此方法可用于化瘀祛斑胶囊中4种柴胡皂苷的含量测定。

3.4 方法评价

本研究中建立的HPLC-ELSD法可同时测定化瘀祛斑胶囊中4种柴胡皂苷的含量，3批样品中均检出柴胡皂苷b2和柴胡皂苷b1，且含量差异不大，可推断出在制剂和生产中存在柴胡皂苷b2和柴胡皂苷b1，因此有必要对其作为指标性成分进行质量控制。该方法具有操作简单、重复性好、专属性强的优点，4种柴胡皂苷作为化瘀祛斑胶囊中柴胡的特征性成分，用于其质量评价与控制，可为提高和改进制剂的质量标准提供科学依据。