不同包埋量固定化酵母对黄酒发酵及风味的影响

徐岳正，王晶晶，蒋予箭，李智慧，2，周建弟，2

（1.浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，浙江绍兴 312000；2.国家黄酒工程技术研究中心，浙江绍兴 312000；3.浙江工商大学食品与生物技术学院，浙江杭州 310012）

固定化技术是用物理或化学方法将游离的酶或细胞限定在一定的空间区域，既能保持本身活性，又能连续反应之后回收和反复利用[1]。传统的酒精发酵用游离细胞发酵，酵母随发酵液不断流失，使发酵罐中酵母浓度不够，造成酒精发酵速度慢，时间长，使用发酵罐多；采用固定化酵母发酵，细胞浓度大，发酵速度快[2]。有外国学者[3]研究发现，如果选择合适的载体固定酵母进行发酵，与游离酵母相比，酯醇比会更高，有利于形成果香和提高风味。

固定化技术已运用于酒精、白酒、葡萄酒、啤酒及果酒的生产，如固定化技术应用于啤酒中能明显缩短主发酵、后发酵时间[4]，也可用于生产低醇或无醇啤酒[5-6]。酵母菌对黄酒发酵有重要作用，它的发酵副产物是黄酒中香气物质的重要来源[7]。在固定化条件下，酵母菌改变了自身存在方式，酵母菌的生存、增殖、发酵不仅受到发酵液的环境、营养物质等的影响，还受到固定化体系、载体传质阻力、载体中其他酵母的影响。

本文研究在固定化条件下酵母包埋量对黄酒发酵过程中理化指标和香气物质生成量的影响，寻找合适的酵母包埋量，为固定化酵母替代传统游离酵母发酵提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

糯米，购于超市；液化酶、糖化酶、麦曲，浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司提供；酿酒酵母，安琪黄酒专用活性干酵母，市售。

耗材及试剂：葡萄糖、海藻酸钠、氯化钙、消泡剂、硫酸铜、次甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、亚铁氰化钾、盐酸、甲基红、无水乙醇、邻苯二甲酸氢钾、酚酞，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。正丙醇，异丁醇，异戊醇，苯甲醛，乙醛，β-苯乙醇，乳酸乙酯，乙酸乙酯，均为分析标准品，≥99.9%(GC)，乙酸(＞99%)，均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

仪器设备：HH-6型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；TG16-WS 型台式高速离心机，沧州路仪实验仪器有限公司；25×16 型血球计数板，泰州市育才教学设备有限公司；血球计数板，泰州市育才教学设备有限公司；44X3 型生物显微镜，上海光学仪器一厂；PHS-3C 型酸度计，上海雷磁仪器厂；ZNCL-BS 型数显恒温磁力搅拌器，上海越众设备仪器有限公司；GC-2014C 型气相色谱仪，日本岛津有限公司；AOC-20i 型自动进样器，日本岛津有限公司；FFAP（30 m×0.20 mm×0.25 μ m）型毛细管色谱柱，上海安因科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母菌液的制备

用天平称取30 g黄酒活性干酵母加入到450 mL已灭过菌的2%葡萄糖溶液中，38 ℃保温活化30 min，再3000 r/min离心10 min，弃去上清液，得到底部的酵母泥。取酵母泥40 g 加入到180 mL 灭菌的蒸馏水中，得到活化好的酵母菌液。

1.2.2 固定化酵母颗粒的制备

将制备的酵母菌液与9 倍1.5%的海藻酸钠溶液混匀，在37 ℃水浴条件下用10 mL注射器滴加到4%CaCl2溶液中。在21 ℃水浴条件下固定化1 h，最后用无菌水冲洗数遍放入0.05% CaCl2溶液，4 ℃平衡过夜，备用。

1.2.3 发酵液制备

糯米用粉碎机粉碎，过60目筛备用。在1000 mL锥形瓶中放入250 g 糯米粉和625 mL 蒸馏水，搅拌均匀后加入1 g液化酶，70 ℃水浴锅中液化60 min，冷却至50 ℃后加麦曲37.5 g保温糖化4 h，3000 r/min离心10 min，上清液于121 ℃灭菌20 min，备用。

1.2.4 黄酒固定化发酵方法

取5 个1000 mL 的锥形瓶，每个瓶中分别加入800 mL 发酵液以及一定数量的固定化酵母颗粒，使发酵液酵母浓度分别为0.2×107个/mL、0.6×107个/mL、1.0×107个/mL、1.4×107个/mL、1.8×107个/mL 5 个水平，置于28 ℃培养箱主发酵5 d，而后在15 ℃下发酵15 d。

主发酵每天取样，后发酵第7 d、9 d、11 d、14 d、17 d、20 d 取样，分别进行酒精度、总糖、总酸的检测，其中检测酒精度所得蒸馏液留样以测定典型香气物质（正丙醇，异丁醇，异戊醇，苯甲醛，乙醛，β-苯乙醇，乳酸乙酯，乙酸乙酯）含量。

1.2.5 理化指标的测定

总糖、总酸、酒精度测定方法参照国标GB/T 13662—2018《黄酒》[8]。

1.2.6 酵母菌数的测定

采用血球计数法测定样品中酵母菌的数量[9]。

1.2.7 香气物质的测定[10]

色谱柱：DB-FFAP 30 m×0.20 mm×0.25 μm 毛细管色谱柱；柱流量：恒流1.5 mL/min(N2)；进样口温度：250 ℃；分流比：25∶1；检测器(FID)温度：280 ℃；氢气：40 mL/min；空气：400 mL/min；补充气(N2)：45 mL/min。柱箱温度：50 ℃(2 min)→(10℃/min)→80 ℃→(20 ℃/min)→150 ℃→(50 ℃/min)→200 ℃(3 min)→(20 ℃/min)→230 ℃(3 min)。

1.2.8 数据处理

采用origin 8.0 和excel 进行实验数据的处理和分析。

2 结果与分析

2.1 酵母包埋量对黄酒理化指标的影响

以不同包埋量的固定化黄酒酵母进行发酵实验，并取不同发酵时间的发酵液进行理化指标的测定，酒精度、总糖、总酸的变化趋势见图1—图5。

从图1—图5 可以看出，虽然酒精度、总糖、总酸由于酵母包埋量的不同在数值上有差异，但总体趋势是相似的。

酒精度在主发酵期间快速上升，然后趋于平稳，这是因为主发酵阶段酵母大量繁殖，利用可发酵性糖产生酒精。总糖在主发酵阶段快速下降，但是由于酵母包埋量的不同，发酵第1 d的总糖出现了较为明显的差异，0.2×107个/mL＞0.6×107个/mL＞1.0×107个/mL＞1.4×107个/mL＞1.8×107个/mL，表明酵母包埋量越大，酵母细胞能在发酵开始时就越快利用糖类物质，随着发酵的进行，差距逐渐缩小。总酸是缓慢上升的变化趋势。

表1 列出了不同酵母包埋量发酵结束后的理化指标。从表1 看出，发酵结束后酵母包埋量为0.2×107个/mL 的总糖含量最高（13.3 g/L），酒精度最低（10.4%vol），包埋量为1.8×107个/mL的酸度最大（4.7 g/L）。酵母包埋量越大，酒精度越高。

2.2 酵母包埋量对黄酒发酵过程中香气物质生成量的影响

表1 不同酵母包埋量发酵结束后的理化指标

发酵结束后各香气物质生成量的差异如图6所示。从图6 可以看出，酵母包埋量对醇类物质的生成影响较大，酵母包埋量为0.2×107个/mL 生成的正丙醇、异丁醇、β-苯乙醇最多，酵母包埋量为1.8×107个/mL生成的异戊醇含量最高，这可能是因为酵母包埋量小时，酵母增殖倍数增多，醇类物质生成增多，而酵母包埋量大时，则酵母基数大，繁殖多，生成的醇类也越多。

酵母包埋量对乙醛生成量的影响较大，0.6×107个/mL 生成量最大；酵母包埋量为1.0×107个/mL的乙酸生成量最多，其他4 个水平之间差异不明显；酵母包埋量为1.0×107个/mL 的生成乙酸乙酯量最大；酵母包埋量为1.0×107个/mL 的生成乳酸乙酯的量最大。由此可见，酵母包埋量为1.0×107个/mL较适合酵母生成酯类物质。

图7 表明了不同酵母包埋量发酵过程中醇类、酯类总量的变化趋势，图8 表明了发酵结束后醇类与酯类含量的比值。

图7 可以看出，酵母包埋量为0.2×107个/mL 生成的醇类总量最多（621.26 mg/L），而酯类总量酵母包埋量为1.0×107个/mL（119.59 mg/L）明显要高于其他4 个水平，其他4 个水平之间差异不明显（62.39～68.66 mg/L）。图8 表明酵母包埋量为0.2×107个/mL和1.8×107个/mL时醇味更重，而酵母包埋量为1.0×107个/mL 发酵的黄酒醇酯比最小（3.77），醇香清雅，酯香味较强，香气更加协调适中。

从图9 可以看出，酵母包埋量为0.2×107个/mL的香气K 值最大（12.87），产生的香气强度大，其次是包埋量为1.0×107个/mL（11.64）。鉴于酵母包埋量为0.2×107个/mL 时，酒精度偏低（10.4%vol），因此综合考虑理化指标和香气物质生成量，酵母包埋量为1.0×107个/mL 是固定化条件下理想的酵母包埋量。

3 结论

通过实验结果表明，黄酒酵母包埋量越大，酒精度越高。发酵结束后酵母包埋量为0.2×107个/mL发酵的黄酒酒精度较低（10.4%vol），包埋量为1.8×107个/mL 时黄酒酸度较大（4.7 g/L），这两种酵母包埋量不适合黄酒发酵。

酵母包埋量为1.0×107个/mL 生成的酯类总量明显高于其他4 个水平，其他4 个水平之间差异不明显，并且酵母包埋量为1.0×107个/mL 发酵的黄酒醇酯比较小（3.77），同时香气K 值较大（12.87），香气强度大，在固定化条件下是理想的酵母包埋量。