GC-MS/MS-SRM 技术在检测白酒中5种吡嗪类化合物的应用研究

李正涛 ，孙 跃，孙海燕，钱 宇，赵金松，，黄志久，李 丹

（1.四川轻化工大学，四川宜宾 644000；2.泸州老窖集团有限责任公司，四川泸州 646000）

吡嗪是1,4 位含氮的六元杂环化合物，其衍生物广泛存在于天然和发酵食品中，具有类似于炒坚果、烤肉的怡人香气[1]，由于它们具有极低的风味阈值，还对其他香味物质有明显的烘托作用，可使白酒的香气更为丰满，对白酒风味有重要贡献[2]。同时,吡嗪类物质也是白酒中一类功能性化合物。有研究表明，吡嗪类化合物具有扩张血管、促进血循环、改善学习障碍、护肝等功能[3]，因此成为近年来白酒养生系列的一个研究热点。目前，白酒中吡嗪类化合物的测定方法主要有顶空固相微萃取、液-液萃取等结合气相色谱FID 检测器、NPD 检测器及质谱的测定[4-5]，或者利用液相色谱-质谱联用法进行测定[6]。王莉等[7]建立了一种利用气质联用的选择离子模式进行分析，直接进样定量白酒中4 种重要吡嗪化合物的方法。该方法直接进样，简单、便捷，但具有较高的检出限，比较适合于检测白酒中含量较高的几种吡嗪，另外，虽然SIM 灵敏度和抗干扰力比SCAN 强，但是SIM 是单离子监测，即只扫描一个离子，相比于SRM，分辨率低，抗背景干扰能力更弱。王柏文等[8]采用顶空固相微萃取结合GC/NPD 技术分析芝麻香型白酒中含氮化合物，结果定性检测到10 种具有风味特征的吡嗪类化合物。这种方法利用液液萃取对样品进行了一定的浓缩，有效提高了仪器对吡嗪类物质的检出，但是整个前处理过程较为复杂，需要经过多次样品转移，因此会使目标化合物有一定的损失，影响定量的准确性。气相色谱－四级杆串联质谱是目前检测机构及白酒企业广泛应用的检验设备。

SRM(selected reaction monitoring)是基于质谱的选择反应监测技术，对质谱数据进行过滤，在母离子中选择符合条件的母离子，进行破碎后形成子离子，在多个子离子中选出符合条件的子离子，经过两次的选择，得到每个物质的母离子和子离子对，有效去除了噪声干扰，因此SRM 模式具有更高的检测范围和灵敏度，更适用于复杂样品混合物的检测，相对于传统的质谱技术更具优势[9]。现阶段，SRM 模式在蛋白质组学[9]、毒药和药品[10]、农残[11]、尿检[12]等领域应用广泛，在白酒中应用相对较少，相关文献报道较少。本研究采用气相串联质谱中的选择反应检测扫描（SRM），建立了一种简单、快速、经济的白酒中5种吡嗪化合物的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：市购的16 种成品酒，编号为C-1、C-2、C-3、C-4、C-5、C-6、C-7、C-8、C-9、C-10、C-11、C-12、C-13、C-14、C-15、C-16，见表1。

标样：2-甲基吡嗪（纯度≥98%）、2,5-二甲基吡嗪（纯度≥98%）购自北京百灵威科技有限公司；2,3,5-三甲基吡嗪（纯度≥98%）、2,3-二乙基吡嗪（纯度≥98%）购自梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；2,3,5,6-四甲基吡嗪购自南京化学试剂股份有限公司。

表1 采集样品信息

试剂：色谱级乙醇购于ANPEL 公司。

吡嗪标准贮备液：分别称取一定量的5 种标准品（精确至0.0001 g）,用60%vol 的乙醇溶解并定容，配制成浓度为1 g/L的标准储备液。

吡嗪混合标准应用液：根据相关学者对白酒中吡嗪类化合物的研究[5，13-15]，分别从吡嗪标准贮备液中取一定的量到100 mL 容量瓶中，用60%vol 的乙醇稀释并定容，使2-甲基吡嗪浓度为1 mg/L，2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基吡嗪浓度为2 mg/L，2,3,5-三甲基吡嗪浓度为4 mg/L，2,3,5,6-四甲基吡嗪浓度为10 mg/L。以此为标准曲线最高浓度点，再逐级稀释4 个梯度，即2-甲基吡嗪为0.0625 mg/L、0.125 mg/L、0.250 mg/L、0.500 mg/L 和1.000 mg/L；2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基吡嗪为0.125 mg/L、0.250 mg/L、0.500 mg/L、1.000 mg/L 和2.000 mg/L；2,3,5-三甲基吡嗪为0.250mg/L、0.500mg/L、1.000mg/L、2.000 mg/L、4.000 mg/L；2,3,5,6-四甲基吡嗪为0.625 mg/L、1.250 mg/L、2.500 mg/L、5.000 mg/L 和10.000 mg/L。使用以上5个梯度绘制标准曲线。

仪器设备：气相串联质谱仪（TRACE 1300-TSQ8000），自动进样器（AI/AS 1310）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；色谱柱为HP-5（30 m×0.25 mm×0.25 μ m）：安捷伦科技有限公司；电子天平购自上海恒刚仪器仪表有限公司，高纯氦气（99.999%）、高纯氩气：南京特种气体有限公司。

1.2 试验方法

气相色谱（GC）条件：起始温度为50 ℃，保留1 min，以10 ℃/min的速率升至70 ℃，再以5 ℃/min的速率升至100 ℃，再以50 ℃/min 升至250 ℃；进样口温度为230 ℃，恒流模式，流速为1 mL/min，分离比为20∶1；进样量为1 μL。

质谱（MS）条件：电子轰击离子源（EI），电子能量70 eV，传输线温度260 ℃；离子源温度280 ℃；溶剂延迟3 min，选择反应检测扫描模式（SRM），离子扫描参数见表2。

表2 5种吡嗪化合物的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 进样方式

本研究的样品皆为市购成品白酒，在相关学者的大量研究中，对于白酒中吡嗪类化合物的检测，较多使用了前处理，比如顶空固相微萃取[14]、液液萃取[15]、旋转蒸发浓缩[16]等。各种前处理方法，虽然对白酒中风味化合物有一定的浓缩作用，但是在前处理过程中，也会损失一部分目标化合物，且耗费时间相对较长，部分前处理方式所使用的仪器价格也比较昂贵。在本研究中使用的SRM 模式，质谱图中只会出现目标化合物，本研究中采用直接进样的方式，相对于进行前处理，此方式操作简单，经济实惠，也不需要使用有机试剂，既大大的缩短了时间，又使目标化合物保留更充分，降低了目标化合物的损失。

2.2 气相串联质谱不同模式对比

使用同一个样品分别进行SCAN 模式，SIM 模式和SRM 模式3 种不同质谱模式检测，其中从SCAN 模式的质谱图（图1）可以看出，样品的全扫描质谱图中，由于存在很多含量相对比较低的风味物质，图形中含量比较低的物质分离效果并不好,很多物质的图形是连在一起的,而且杂峰比较多，该种模式不太适合用于检测含量比较低的风味物质,通常全扫描模式用于定性分析。SIM 模式是选择离子扫描模式，用该模式检测样品时，图形中只会出现拥有事先输入碎片离子的化合物峰，如图2所示，图形中杂峰相对于全扫描模式要少很多，虽然这种模式相对于全扫描模式有一定的选择性，但是在这种模式下，仍然会出现一些含有特征离子的非目标化合物峰，SIM 模式用于定量检测微量化合物，必须要找出独特的离子碎片，否则会出现一些干扰性杂峰，因此SIM 模式在专一性上存在一定的缺陷。SRM 模式是选择反应监测模式（图3），从图3 可看出，图形中只有目标化合物峰，没有其他杂峰，在这种模式下，无论目标化合物的含量是相对比较低还是较高，图形中只会出现目标化合物，选择性非常高，而且在目标峰能够分离的情况下，该种模式可以尽可能的缩短检测时间，有利于建立一种快速检测方法，适合于微量化合物的定量检测分析。综上所述，SRM 模式相对于另外两种模式,具有更强的抗噪音干扰能力,更强的灵敏度,更高的准确性,因此本研究采用选择反应检测扫描模式（SRM模式）对样品进行定量分析检测。

2.3 质谱SRM的优化

使用直接进样分析目标化合物的混合标准使用液，对5 种吡嗪类化合物进行质谱全扫描分析。首先根据总离子图确定5 种吡嗪化合物的出峰时间，在SRM 优化过程中，5 种吡嗪化合物进入一级质谱后，通过每种化合物的出峰时间找出对应化合物，确定其对应母离子，母离子进入二级质谱，对过滤后的母离子进行碎裂，确定母离子对应的最优子离子；母离子与子离子对确定后，对化合物母离子逐一施加一定步长的碰撞能量（CE），确定母离子与子离子对的最佳碰撞能（EC）。每个目标化合物选取2 对最具特征且响应最高的SRM 离子及相应的仪器参数作为最终的质谱采集参数（见表2）。

表3 5种吡嗪类化合物的保留时间、线性回归方程、线性范围及相关系数

2.4 标准曲线、精密度及检测限

将配制好的标准溶液分别按照上述条件进行检测分析，得到5 种吡嗪类化合物的标准曲线线性方程，其线性回归方程、线性范围和相关系数见表3。在酒精浓度为60%vol 的乙醇水溶液中添加混合标准溶液，使5 种吡嗪类标样浓度均为50 μg/L，在相同的条件下连续检测6 次，以信噪比S/N=3 确定方法检出限（limit of detection，LOD）[14]；根据5种吡嗪在白酒中含量不同,酒样中加入不同浓度的吡嗪标液进行加标回收率试验,其中2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪分别添加0.125 mg/L、0.5 mg/L、1.25 mg/L；2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪分别添加0.25 mg/L，每个添加水平分别做6 个平行样品，利用6 个平行样品的实验数据计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），即为该方法的精密度，结果见表3。

由表3 可知，5 种标准物质在相应的线性范围内，线性关系良好，相关系数都在0.99以上。由表4可知，回收率在98.52%～103.46%，相对标准偏差(RSD)在0.28%～3.14%，方法检出限（LOD，S/N＝3）在10～14 μg/L，样品的加标回收率较高，说明本方法在检测过程中，目标物质损失较少；相对标准偏差值较低，精确度高；具有较低的方法检出限，满足白酒中吡嗪类痕量物质检测的实验要求。

表4 回收率、相对标准偏差及检出限

2.5 样品分析

按照试验方法定量分析16 种市购成品白酒,其5 种吡嗪类化合物的含量如表5。由表5 可知，在这16 种酒样中，都检测出了这5 种吡嗪类化合物，每种酒样的四甲基吡嗪含量都要明显高于其他4 种吡嗪类化合物，说明在这5 种吡嗪类化合物中，四甲基吡嗪可能占据着主导地位；酱香型白酒中，仅次于四甲基吡嗪含量的是2,3,5-三甲基吡嗪；然而在浓香型、兼香型和芝麻香型白酒中，仅次于四甲基吡嗪的含量为2,3-二乙基吡嗪，居于第二位；除酱香型外，另外3种香型白酒中，2-甲基吡嗪在5种吡嗪中含量最低。从检测的所有样品来看，对于这5 种吡嗪类化合物的总含量，酱香型白酒中含量最高，其次分别是芝麻香型、兼香型、浓香型；这也符合范文来等[17]在文献中提到的酱香型白酒中吡嗪类化合物含量最高的说法。

表5 白酒中5种吡嗪类化合物的含量 (mg/L)

3 结论

通过优化实验条件,采取选择反应监测模式(SRM 模式)，建立了一种气相色谱四级杆串联质谱(GC-MS/MS)快速定量方法，可在12 min 内完成白酒中5 种吡嗪类化合物的定量分析,该方法采用直接进样的方式，既节约了前处理所需时间,也减少了目标物在前处理过程中的损失，更加适用于企业的定量分析。在该方法条件下，5 种吡嗪类标准物质都具有良好的线性关系，相关系数在0.9904～0.9994，相对标准偏差(RSD)在0.28%～3.14%，方法检出限在10～14 μg/L，加标回收率在98.52%～103.46%,线性关系、精密度、检出限和加标回收率均满足白酒中吡嗪类痕量物质检测的实验要求。

本实验结果显示，在酱香型白酒中，5种吡嗪的总含量最高，可达20.15 mg/L，浓香型白酒最高可达3.66 mg/L；在所有白酒样品中，5 种吡嗪类化合物中四甲基吡嗪含量最高，其中酱香型白酒中最高可达11.67 mg/L。由于中国白酒的香型工艺种类繁多，白酒的风格特点也各不相同，还需要进一步加大研究的范围，并进行定量检测。