pH和温度敏感的PTX-DEGMA接枝壳聚糖聚合物的制备及药物释放

张雪静，牛世伟，朱利民

(东华大学 化学化工与生物工程学院，上海 201620)

乳腺癌已成为威胁广大女性身心健康的常见肿瘤疾病之一。临床实践表明化学疗法是治疗癌症的主要方法，然而由于化疗药物自身存在水溶性差、生物利用度低等问题，限制了化学疗法的应用[1-4]。众所周知，开发新型癌症治疗药物成本高、周期长且面临较大风险，因此基于现有药物研制新型传输系统成为首选方案。新型递送系统普遍具备优异的稳定性和良好的生物相容性[5]，并且可以很好地利用肿瘤部位的增强渗透和滞留(enhanced permeability and retention, EPR)效应。文献[6]研究指出，由于肿瘤细胞和正常细胞表面的表达因子大有不同，因此可以通过在药物递送系统上添加特殊配体，利用配体靶向肿瘤细胞上的高表达因子，从而增加肿瘤组织对药物的摄取，减少对正常组织的毒副作用。壳聚糖(chitosan, CS)具有良好的生物相容性，其在生物医学中应用广泛，包括药物和基因递送、组织工程、伤口愈合和抗微生物剂等方面[7]。由于壳聚糖分子中存在氨基，其在酸性环境中质子化后促使电荷发生转变，使得壳聚糖本身具有pH敏感特性，可在肿瘤内环境中产生响应[8-9]。二聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)可生物降解，且在低临界温度时结构会发生改变，形成非均匀状浊液，是一种较好的温敏性材料[10-11]。将DEGMA接枝到壳聚糖上，由于壳聚糖是两亲性材料，其在水相中可以自组装成纳米颗粒，疏水性药物将被装载于纳米颗粒的内核，而DEGMA则在纳米颗粒的外层。当纳米颗粒进入肿瘤环境后，由于温度的升高，DEGMA的结构发生变化，又由于壳聚糖的pH敏感性，纳米颗粒发生裂解，药物得以释放。紫杉醇(paclitaxel, PTX)作为萜类复杂的次生代谢物，是一种广谱高效的抗肿瘤药物，其可以在细胞分裂过程中通过稳定微管抑制细胞的解聚，致使肿瘤细胞凋亡，从而达到抗癌作用。紫杉醇由于具有其独特且新颖的作用机制以及效果显著的抗癌特性而受到国内外许多药理学家和生物学家的青睐[12-15]。基于上述研究，本文设计了DEGMA接枝的pH和温度敏感的壳聚糖聚合物。

1 试验部分

1.1 材料

壳聚糖(脱乙酰度>90%)、乙酸酐、乙二酸、乙醚、丙酮，购自国药集团化学试剂有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二环己基碳二亚胺(DCC)、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDACT)、二聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、紫杉醇(PTX)，购于阿拉丁公司(中国上海)；透析袋(截留相对分子质量为3 500)；超纯水。

1.2 仪器设备

Avance 400型核磁共振谱仪，瑞士Bruker公司；JEM-2100型透射电子显微镜，日本JOEL公司；BI-200SM型动态光散射仪，美国Brookhaven公司；LC-20AT型高效液相色谱仪，日本Shimadu公司；LAMBDA 35型紫外分光光度计，美国PerkinElmer公司。

1.3 试验方法

1.3.1 乙酰化壳聚糖的制备

取5 g壳聚糖溶于一定浓度的醋酸溶液中，室温下磁力搅拌使壳聚糖完全溶解，然后加入250 mL无水乙醇搅拌至澄清，再加入0.5 mL乙酸酐，密封容器室温下磁力搅拌一段时间至溶液澄清。加入质量分数为10%的NaOH使壳聚糖完全析出，将析出的壳聚糖过滤，冷冻干燥后取出研磨成均匀细小的粉末，即乙酰化的壳聚糖(N-CS)。

1.3.2 壳聚糖大分子链转移剂的制备

取0.292 g乙酰化的壳聚糖溶于30 mL DMF中，在DCC(0.205 g)和DMAP(0.015 g)存在的条件下，将0.37 g链转移剂DDACT缓慢加入其中，室温下磁力搅拌约40 h，之后将反应物加入冰水中放入透析袋(截留相对分子质量为3 500)中透析3 d，第1 d每2 h换一次水，第2 d每4 h换一次水，第3 d每8 h 换一次水。将透析后的沉淀物冷冻干燥，得到淡黄色壳聚糖大分子链转移(N-CS-RAFT)试剂。

1.3.3 乙酰化壳聚糖的接枝改性

取0.046 8 g N-CS-RAFT溶于5 mL DMF中，在氮气氛围保护下磁力搅拌约4 h至完全溶解；再加入0.003 2 g引发剂AIBN和1 g DEGMA，在氮气保护下于40 ℃油浴中磁力搅拌24 h。反应结束后加入10倍体积的冰乙醚置入冰箱沉淀12 h，去除乙醚收集沉淀，将沉淀放入透析袋透析3 d，透析后的沉淀放入40 ℃真空干燥箱直至完全干燥，即可得到N-CS-g-PDEGMA聚合物。最后将获得的N-CS-g-PDEGMA纳米颗粒溶于质量分数为10%的醋酸溶液中，搅拌24 h水解去掉N-乙酰基，冷冻干燥得到CS-g-PDEGMA。

1.3.4 CS-g-PDEGMA的载药及释药

取20 mg CS-g-PDEGMA溶解于水中，取5 mg PTX溶解于乙醇中，将溶解的PTX缓慢滴入CS-g-PDEGMA溶液中超声振荡30 min，在室温下反应24 h后用截留相对分子质量为3 500的透析袋室温下透析3 d以去除小分子杂质和未包封的药物，透析后的溶液以6 000 r/min的速度离心30 min，冷冻干燥得到CS-g-PDEGMA/PTX粉末。

取CS-g-PDEGMA/PTX溶于超纯水，完全溶解后用高速离心机离心，转速为10 000 r/min，离心时间为30 min。收集离心后的上清液，用商效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法测定上清液中紫杉醇的含量。包封率和载药率分别根据式(1)和(2)计算，得到包封率为73%，载药率为12.1%。

(1)

(2)

式中：Ee为包封率，%；Ed为载药率，%；mp为PTX的质量，mg；ms为上清液中的PTX质量，mg；m为载药纳米颗粒的总质量，mg。

取5 mg CS-g-PDEGMA/PTX溶于1 mL磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline, PBS)溶液中，待其充分溶解后，分别取50 μL置于两个微量透析管中，将其悬浮于离心管内，离心管中分别加入pH值为7.4和5.0的PBS溶液各20 mL，将离心管置于37 ℃水浴振荡器中，振荡频率为100次/min，定时取1 mL样品；或者，分别取50 μL置于两个微量透析管中，将其悬浮于离心管内，在离心管中加入pH值为7.4的PBS溶液，分别将其置于25和37 ℃水浴振荡器中，振荡频率为100次/min，定时取1 mL样品，取样后再补充1 mL预热的PBS溶液。取出的样品在高速离心机中离心，转速为10 000 r/min，时间为30 min。用HPLC法测定上清液中的紫杉醇含量。整理数据后计算药物释放情况。

1.3.5 材料及载药纳米颗粒的表征

CS-g-PDEGMA的结构表征。取5 mg CS-g-PDEGMA样品溶于0.5 mL的氘代二甲基亚砜中，用Avance 400型核磁共振波谱仪对其进行测试分析。

CS-g-PDEGMA聚合物的低临界溶解温度(lower critical solution temperature, LCST)测定。取CS-g-PDEGMA溶液对其进行稀释，用LAMBDA 35型紫外分光光度计测其LCST，设置升温温度区间为20～60 ℃。

CS-g-PDEGMA/PTX的形貌表征。取1 mg CS-g-PDEGMA/PTX样品溶于2 mL超纯水中配制成质量浓度为0.5 mg/mL的溶液，滤膜过滤后取一滴CS-g-PDEGMA/PTX溶液滴到铜网上，自然晾干后于JEM-2100型透射电子显微镜下观察形态。

CS-g-PDEGM/PTX的粒径测定。使用BI-200SM型动态光散射仪对CS-g-PDEGMA/PTX的形貌表征时经滤膜过滤的溶液进行测试。

2 试验结果

2.1 核磁共振氢谱分析

CS-g-PDEGMA的核磁共振图谱(1H-NMR，400 MHz，DMSO)如图1所示。由图1可以看出：在化学位移1.2～3.0(c～a)处是壳聚糖RAFT试剂的特征峰带，表明壳聚糖RAFT试剂已成功制备；在化学位移4.2附近(b)处出现了PDEGMA主链上氢的特征峰，表明DEGMA已经成功接枝；在化学位移5.6～6.2处是壳聚糖上—CH—的特征峰；在化学位移3.0～4.0处是溶剂氘代二甲基亚砜的特征峰。以上特征峰的出现表明已成功制备出CS-g-PDEGMA。

2.2 CS-g-PDEGM的温敏特性

DEGMA和其他温敏性材料一样都是具有LCST的聚合物，其中LCST是指温敏聚合物达到溶液最大吸光度50%时所对应的温度值。CS-g-PDEGMA水溶液的吸光度曲线如图2所示。由图2可以看出：接枝共聚物CS-g-PDEGMA在27～37 ℃ 发生了明显的相变，直到39 ℃相变依然存在，其LCST值约为33 ℃，表明所制备的聚合物具有很好的温度响应性。

2.3 CS-g-PDEGM/PTX形貌及粒径分析

CS-g-PDEGMA/PTX的透射电镜图及其粒径分布如图3所示。由图3可以看出，CS-g-PDEGMA/PTX聚合物分散良好，基本呈球形。由TEM图计算得聚合物颗粒的平均粒径为(130.0±12.6)nm，而由动态光散射仪测得的粒径结果显示，聚合物颗粒的平均粒径为(180.0±17.4)nm且分布均匀，其测得的粒径比由TEM计算得出的粒径值略大。这是因为TEM检测样本在制备过程中会脱水，导致粒径减小。

Fig.3 TEM image and particle size distributionof CS-g-PDEGMA/PTX

2.4 紫杉醇的体外释放

PTX在不同pH值和温度下的释放情况如图4所示。由图4可知，当温度相同时，pH值为7.4时的PTX累计释放率低于pH值为5.0时的释放率，这是由pH敏感的纳米颗粒在酸性环境下被降解所导致的。此外，初始阶段药物释放较快，随着时间的延长，PXT释放速率逐渐降低。在48 h内，当pH值为5.0且温度为37 ℃时，PTX累计释放率最高只有46.6%，而在pH为5.0且温度为39 ℃时PTX累计释放率最高达70%。这是由于温度从37 ℃增加到39 ℃时，DEGMA结构发生变化导致纳米颗粒的结构坍塌，进而导致PTX释放率增加，表明CS-g-PDEGMA/PTX纳米颗粒具有温度响应特性，即随温度的升高累积释放率升高。由此可见，CS-g-PDEGMA/PTX纳米载药系统能很好地响应肿瘤微环境进而控制药物释放。

3 结 语

本文利用RAFT聚合法合成了加载PTX并接枝DEGMA的pH和温度敏感壳聚糖聚合物。核磁共振氢谱表明该聚合物已成功制备；透射电子显微镜和动态光散射仪表征结果显示制备的壳聚糖聚合物呈球形，粒径呈正态分布且分散良好；紫外分光光度计测试结果显示该纳米颗粒的LCST为33 ℃；载药试验和体外药物释放研究表明，该壳聚糖聚合物的载药率为12.1%，包封率为73%，并且具pH和温度响应性和缓释效果。