双重指示标签对鲤鱼新鲜度的实时监测

王佳燕,刘秀英,*,李学鹏,*,王 昱,王 宇,高 雪,励建荣,郭晓华,于建洋

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心(大连工业大学和渤海大学),辽宁锦州 121013;2.山东美佳集团有限公司,山东日照 276800;3.荣城泰祥食品股份有限公司,山东威海 264309)

随着人们生活水平的不断提高,消费者对食品品质和质量安全的重视程度逐渐提高。鱼肉营养丰富,味道鲜美,受到消费者的青睐,但其在酶与微生物的共同作用下极易腐败变质。因此,如何准确判断鱼肉的新鲜度对消费者显得尤为重要[1]。

目前鱼新鲜度的评价方法主要有感官评价法、微生物法和理化指标检测法[2-4]。日常消费者主要使用感官评价法对的新鲜度进行评价,其结果具有一定的主观性。微生物和理化指标检测法需要进行样品前处理,耗时长,检测过程操作复杂[5]。这些方法均无法满足消费者对鱼新鲜度进行实时的监测。近年来一些新型检测技术例如计算视觉、色谱法以及电子鼻等新技术受到研究者们的广泛关注,并逐渐被应用到鱼新鲜度的检测中[6-8]。然而这些技术存在检测成本高、需要专业的检测设备和技术人员等问题[9-11]。因此,开发一种快速、实时、无损的鱼新鲜度检测方法具有重要意义,这将有助于消费者在现场直接快速地获取信息。

智能包装可以有效的保证包装产品的品质,延长货架期,并能够指示食品的新鲜度[12]。新鲜度指示卡是新型智能包装的一种,能够与食品在贮藏过程中产生的特定物质响应产生特征颜色反应引起指示卡的变化,进而判断包装内食品的新鲜程度。近年来,国内外学者对食品新鲜度指示卡的研究逐渐增多[13-16]。王冰雪等以溴甲酚紫为指示剂,制备新鲜度指示卡对猪肉新鲜度进行测定,结果显示该指示卡对不同重量的猪肉均有良好指示效果[17]。Dudnyk等以果胶为基材,以红甘蓝提取物为指示剂,发明了一种可食用的新鲜度指示卡,指示卡上含有的红甘蓝提取物对pH敏感,与肉或海产品贮藏过程中释放出的含氮碱性化合物相互作用发生变色,用肉眼即可对新鲜度进行判断[18]。然而这些方法均采用单一的指示剂对新鲜度进行指示,存在对新鲜度临界点判断灵敏度低的问题。

本文采用溴酚红和溴甲酚紫两种指示剂构建双重指示标签,以双重颜色变化为参比对鱼的新鲜度进行实时无损的监测。提取指示卡的R、G、B值,基于HSV模型,将指示卡的颜色变化与鱼的TVB-N值进行关系拟合,进而实现对鱼新鲜度的定量分析。以期制备的双标签智能指示卡可用于实时无损的监测鱼新鲜度变化,使消费者能够更直观的对鱼新鲜度进行现场判断。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲤鱼(新鲜活鱼) 当地水产市场,均重约1 kg;溴甲酚紫 上海三爱思试剂有限公司;溴酚红 上海金穗生物科技有限公司;无水碳酸钠、硼酸、溴甲酚绿 天津化学试剂有限公司;甲基红 天津市致远化学试剂有限公司;氯化钾、甘油、阿拉伯胶、无水碳酸钾 阿拉丁试剂有限公司。

E-3150型pH计 上海雷磁仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 双重新鲜度指示标签的制备 实验中选取滤纸作为基材,采用浸染吸附的方法对指示剂进行固定,制备指示标签。双重指示标签由外圈指示标签和内圈指示标签两部分构成。外圈指示标签为溴酚红(BPR)浸染滤纸,内圈指示标签为溴甲酚紫(BCP)浸染滤纸。外圈指示标签的具体制备方法如下:配制浓度为3 mg/mL的溴酚红乙醇溶液,取一张干净的滤纸浸入到该溶液中。浸泡12 h后,将滤纸取出,自然干燥。将干燥后的溴酚红滤纸利用打孔器裁剪成直径为2 cm的圆形,备用。内圈指示标签的制备方法同外圈指示标签的制备方法相似,不同的是用于浸染滤纸的溴甲酚紫乙醇溶液浓度为1 mg/mL,裁剪尺寸为直径1 cm的圆形。最后将外圈和内圈指示标签用双面胶以同心圆的方式拼装成双重指示标签。

1.2.2 指示剂颜色变化分析方法 分别配制浓度为1 mg/mL的溴甲酚紫乙醇溶液和2 mg/mL的溴酚红乙醇溶液备用。配制pH为2～9的溶液,其中pH2、3、4、5、6为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液,pH7、8、9为硼砂-硼酸缓冲溶液。量取不同pH缓冲液5 mL置于试管中,向其中各滴加1滴溴甲酚紫或溴酚红乙醇溶液,混匀。分别对不同pH下指示溶液进行拍照保存,并对拍摄记录的两种指示溶液颜色变化进行分析。

1.2.3 双重指示标签检测鱼新鲜度 实验中所用到鱼样均为活鱼,购买后将活鱼在30 min内运送到实验室。将鱼宰杀后,除去鱼的头尾,去皮剔骨,只保留鱼肉作为测试样品。取鱼肉10 g放在10 mL的烧杯中。将按照1.2.1的方法预先制备好的指示标签粘贴在保鲜膜上。用贴有指示标签的保鲜膜对装有鱼肉样品的烧杯进行封口处理,指示标签面向烧杯内侧。将烧杯置于25 ℃恒温箱中进行储存,每隔2 h采集一次指示标签的图像。每次测试做三个平行样品。

1.2.4 鱼样挥发性盐基氮(TVB-N)的测定 TVB-N的测定方法主要参考国家标准GB/T-5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中规定的微量扩散法[19]。用搅拌机将试样绞碎搅匀,称取试样10 g,加入100 mL去离子水。振摇,使试样在样液中分散均匀,浸渍30 min后过滤,所得的滤液备用。

将水溶性胶涂于扩散皿的边缘,在皿中央内室加入硼酸溶液1 mL及1滴混合指示剂(1∶5的甲基红乙醇溶液∶溴甲酚绿乙醇溶液)。在皿外室准确加入上述处理后得到的滤液1.0 mL,盖上磨砂玻璃盖。然后从缝隙处快速加入1 mL饱和碳酸钾溶液,立刻平推磨砂玻璃盖。将扩散皿于(37±1) ℃恒温箱内放置2 h,取出后放凉至室温,再用硫酸标准滴定溶液(0.0100 mol/L)滴定,滴定至终点颜色至紫红色。记录所消耗的标准滴定溶液的体积,并计算挥发性盐基氮的含量。

1.2.5 鱼肉pH的测定 pH的测定主要参考国家标准GB 5009.237-2016《食品安全国家标准 食品pH的测定》[20]。用搅拌机将试样绞碎搅匀,称取试样2.0 g,加20 mL的0.1 mol/L氯化钾溶液,均质。取一定量能够浸没或埋置pH计电极的试样,将电极插入试样中,将pH计的温度补偿系统调至试样温度,测定并记录读数。

1.2.6 新鲜度指示卡颜色变化与TVB-N含量的拟合分析 应用Photoshop软件,提取所采集照片的RGB数值。每张图像在上、中、下三个区域分别提取RGB,计算平均值。对于颜色不均匀的图像,分别对图像边缘和中心等不同颜色区域提取RGB值三次,计算平均值。根据HSV(色调饱和值)颜色模型,计算色调值(H值)[21],计算公式如下:

如果R=max,H=(G-B)/(max-min)×60

式(1)

如果G=max,H=120+(B-R)/(max-min)×60

式(2)

如果B=max,H=240+(R-G)/(max-min)×60

式(3)

如果H<0,H=H+360

式(4)

1.3 数据处理

实验中用Origin 2018b对TVB-N和pH变化趋势进行分析;利用Photoshop CS5和Powerpoint2017对手机采集的图像进行处理。

2 结果与分析

2.1 指示剂的颜色变化

为了观察溴酚红和溴甲酚紫两种指示剂的颜色变化趋势,研究中将两种指示剂溶解在不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中。结果如图1(a)所示,在pH3～8的范围内,用于制作外圈指示卡的溴酚红指示剂颜色从最初明亮的黄色变为淡黄色,再由淡黄色变为淡粉色,最终在pH大于7的情况下变为粉紫色。如图1(b)所示,用于制作内圈指示卡的溴甲酚紫指示剂颜色在pH3～5的范围内呈现黄色,并且随着pH的上升,黄色逐渐变淡。当pH为5时,溴甲酚紫由淡黄色变为淡紫色,随着pH的进一步升高,紫色逐渐变深。以上颜色变化表明将这两种指示剂用于指示卡的制备具有一定的可行性。

图1 不同pH溶液中(a)溴酚红和(b)溴甲酚紫的颜色变化Fig.1 Color changing of(a)Bromophenol red and(b)Bromocresol purple in different pH solutions

2.2 鱼肉TVB-N随贮藏时间的变化

在室温贮藏条件下,随着贮藏时间的延长,由于微生物和酶的作用,鱼肉中的蛋白质会分解产生氨和胺类等碱性含氮挥发性物质,导致TVB-N含量不断上升。如图2所示,在贮藏时间低于14 h时,由于微生物增殖和蛋白质分解均比较缓慢,随着贮藏时间的延长,TVB-N含量缓慢上升。此时鱼肉有光泽,颜色均匀,新鲜度良好。在贮藏时间为14 h时,TVB-N的含量为14.3 mg/100 g,接近优级品。贮藏16 h后,TVB-N含量迅速上升,在贮藏时间24～26 h之间,TVB-N含量接近合格品临界点。在贮藏时间超过26 h时,TVB-N的含量高于30.09 mg/100 g,鱼肉发生腐败。

图2 鱼肉TVB-N随贮藏时间的变化趋势Fig.2 Trends of TVB-N value of fish sample

2.3 鱼肉pH随时间的变化

鱼体pH的变化与鱼的腐败变质之间存在一定相关性,鱼体鲜活时肌肉的pH接近中性,死后由于肌肉中的糖原分解为乳酸,ATP分解产生磷酸,导致pH下降。鱼体腐败后,蛋白质分解后会产生氨及胺类等碱性含氮物质,pH逐渐上升[22]。如图3所示,随着贮藏时间的延长,鱼肉的pH呈现先下降后上升的趋势。在贮藏时间低于20 h时,鱼肉的pH缓慢降低。在贮藏时间为20 h时,pH从初始的6.78降低到最低点6.63,这与微生物迅速增殖,致使鱼肉中大量乳酸积累有关。此时的鱼肉的TVB-N含量仍低于国家标准的腐败临界点。随着贮藏时间的继续延长,鱼肉的pH迅速上升,在28 h时达到6.84,这是鱼肉蛋白质分解产生碱性含氮物质所致。

图3 鱼肉pH随贮藏时间的变化趋势Fig.3 Trends of pH value of fish sample

2.4 室温下新鲜度指示卡的显色效果

图4表示室温下贮藏28 h的实际鱼样对双重指示标签的颜色变化响应。在室温下,内圈指示标签的初始颜色为黄色,在贮藏时间低于14 h时,内圈指示标签的颜色没有发生明显的变化,14 h时的TVB-N含量为14.3 mg/100 g。参考国家标准GB/T 18108-2019《鲜海水鱼通则》的规定,优级品的TVB-N浓度范围为15 mg/100 g以下,合格品的TVB-N浓度范围为30 mg/100 g以下[23]。因此,此时的鱼样为优级品。随着贮藏时间的延长,内圈指示标签的黄色逐渐变暗。在贮藏时间超过26 h时,指示标签内圈的颜色变为紫色,此时的TVB-N含量迅速上升,为30.09 mg/100 g,达到腐败临界值,鱼肉样品发生腐败,不可食用。与此同时,在鱼样的贮藏过程中,随着贮藏时间的不断延长,指示卡外圈颜色由鲜亮的橙色逐渐变为棕黄色,在鱼肉发生腐败后,颜色最终变为紫色。通过新鲜度指示卡颜色变化和相应的TVB-N含量,可以判断鱼的新鲜等级。然而,当使用单重指示标签指示新鲜度时,通过单一的颜色变化对鱼样的新鲜等级界线区分不明显。将两种指示剂结合,制备双重指示卡,当内圈和外圈同时变化的情况下判断鱼的新鲜等级更加清晰准确。当鱼开始腐败时,我们可以用肉眼观察到新鲜度指示标签的内圈和外圈均变为紫色。因此,本研究制备的双重新鲜度指示标签检测鱼新鲜度是可行的,可以作为零售商和消费者实时、快速、无损的检测鱼新鲜度的一种有效手段。

图4 实际鱼样对双重新鲜度指示卡的颜色变化响应Fig.4 Response of the fish sampleto the color change of the indicator card

2.5 新鲜度指示卡颜色变化与TVB-N含量的拟合分析

TVB-N的含量是评估鱼新鲜等级的重要指标之一。色调饱和值(HSV)颜色模型是根据颜色的直观特性所创建的一种颜色空间。本研究将TVB-N的含量与色调值(H值)进行相关性拟合分析,进而可以实现根据指示标签的颜色变化信息计算实际鱼样TVB-N含量的定量分析。经分析发现,在TVB-N含量低于15 mg/100 g(优级品)时,指示标签外圈的色调饱和度与TVB-N含量存在良好的拟合关系。拟合结果如图5所示,鱼样在室温条件下随着贮藏时间的延长,TVB-N含量不断上升,相应的H值也逐渐升高。当TVB-N含量低于11 mg/100 g时,H值增加迅速,随着TVB-N含量的继续增加,H值的上升趋于平缓。与此同时,指示标签外圈的颜色从鲜亮的橙黄色逐渐变暗,最终变为棕黄色。将TVB-N含量和H值进行多项式拟合后(拟合曲线如图4的红色线所示),得到拟合方程为Y=-53.9463+13.238x-0.48757x2,相关系数为R2=0.982。相关系数0.982证明H值和TVB-N含量的拟合关系良好。因此,人们不仅可以通过裸眼判断鱼的新鲜程度,还可以从新鲜度指示标签的图像上获取H值,进而计算鱼样的TVB-N含量。

图5 H值随TVB-N含量的变化趋势Fig.5 Trend of H value with TVB-N content

3 结论

本研究以滤纸为基材,以溴甲酚紫和溴酚红为指示剂,制备了双重指示标签用于鱼新鲜度的检测。溴甲酚紫和溴酚红两种指示剂在不同的pH下能呈现良好的颜色变化。鱼肉样品在腐败变质过程中随着贮藏时间延长,TVB-N含量增加,鱼肉样品顶空的碱性逐渐增加,致使双重指示标签的内圈和外圈都发生了不同程度的颜色变化。将所制备的双重新鲜度指示标签应用于鱼新鲜度指示,当实际鱼样贮存时间达到14 h时,指示标签的内圈的黄色变暗,外圈颜色由鲜亮的橙色变为浅棕色,鱼样由优极品变为合格品。当贮藏时间达到26 h时,指示标签的内圈和外圈颜色均变为紫色,鱼样发生腐败。基于HSV模型和TVB-N含量进行关系拟合,拟合度良好,可以进一步通过指示标签的颜色变化计算鱼样中TVB-N的含量。该研究成果表明利用溴甲酚紫和溴酚红两种指示剂制备双重指示标签,可以用于对鱼新鲜度的指示,且所制备的标签成本低廉,方便零售商和消费者对鱼肉新鲜度的实时监测,具有一定的应用潜力。