酵母菌发酵制备葛根酵素的工艺优化

朱德艳

(荆楚理工学院,湖北荆门 448000)

葛根是豆科植物野葛的干燥根[1-2],是我国传统的常用中药材之一,可药食两用。葛根的化学成分主要有黄酮类、三萜皂苷类、葛酚苷类、香豆素类、有机酸等[3]。《药典》中记载“葛根味甘、辛,性凉,归脾、胃、肺经,解肌退热,生津止渴,透疹,升阳止泻,通经活络,解酒毒”是临床应用较为广泛的一种中药[4]。在现代科学研究中发现葛根还具有保肝护肝、免疫调节、抗肿瘤、保护心脑血管、降血糖、抗氧化、降血糖、降血压、抗炎、雌激素样作用、改善肾功能、增加骨密度、保护神经等药理功能[5-7]。葛根中含有大量膳食纤维,可调理肠胃,有助于排出体内毒素;长期食用还可以使皮肤光滑,美容养颜。而且葛根中还富含了大量的黄酮类化合物,是一种天然抗氧化剂,且具有降血脂、增强免疫力等多种功效[8-12]。

酵素是采用一种或多种原料,经有益菌发酵的含有多种酶和次级代谢产物等成分的发酵产品[13],是一类特殊的具有催化功能的复杂蛋白质,一部分由人体自身生成,一部分由饮食补充。对机体健康而言,酵素扮演着不可或缺的角色,其数量减少或性能衰退会引发各种不适症状[14]。酵素的功能很多,可以促进新陈代谢、增强胃肠道的消化吸收、调节人体机能、抗氧化性、抗疲劳、美容养颜等[15-18]。近年来,随着人们生活水平质量的提高,越来越多的人都很注重提高自身的健康和保健,对于保健品和健康的饮食的需求也越来越高,而“体内酵素的性能和数量”是衡量健康的一项重要指标[19]。

韩国、日本、欧洲等国家较早对酵素进行了研究与开发[20-27],国内现在逐渐研发了一些新型的酵素饮品[28-30],但对于复杂的发酵过程及加工工艺研究不够深入[31]。本实验以葛根为主要原料,在单因素的基础上,以黄酮含量为响应值[32],采用响应面优化酵母菌发酵制备葛根酵素的工艺参数,为葛根的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛根 湖北省仙之灵食品有限公司;芸香叶苷(卢丁) 成都曼思特生物科技有限公司;高效活酵母 安琪酵母股份有限公司;纤维素淀粉酶 天津市广成化学试剂有限公司,亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、乙醇、柠檬酸 均为分析纯,天津市福晨化学试剂厂;碳酸氢钠、葡萄糖 均为分析纯,天津市广成化学试剂有限公司。

JY1002电子天平 上海上天精密仪器有限公司;DK-98-1恒温水浴锅 亚荣生化仪器厂;YC10-18L高压蒸汽灭菌锅 北京中西远大科技有限公司;DH-600电热恒温培养箱 北京科伟永兴仪器有限公司;PH20恒温摇床 上海一恒科学仪器有限公司,LB20T手持测糖仪 广州铭睿电子科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葛根酵素的加工工艺流程 葛根酵素工艺流程见图1。葛根清洗后,烘干粉碎,按照比例1∶10 g/mL加入蒸馏水进行混合,加热煮沸1 h,冷却后加入纤维素淀粉酶进行酶解,酶的添加量为14 U/g,在50 ℃的水浴中酶解2 h。在酶解完成后的葛根试液中按照1∶10 g/mL的比例加入白砂糖调节葛根溶液的糖度,调整糖度至18%。将高效活酵母按1%的比例进行配制,准确称量后加入到温度为35 ℃的糖水中溶解活化,放置30 min后备用。将处理好的葛根试液装瓶后放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌,在90 ℃的温度下,灭菌15 min后冷却至室温。向处理好的葛根试液中,按照试验中要求的比例接种活化后的酵母菌进行发酵。向接种好的葛根试液,在试验要求的发酵时间、发酵温度、发酵液的pH和菌种的接种量的条件下,静置发酵,发酵结束后测量葛根酵素中黄酮的含量确定最佳的发酵工艺。

图1 工艺流程Fig.1 Technological process

1.2.2 葛根酵素中黄酮含量的测定 葛根酵素中黄酮含量的测定方法参考文献[33]。选取芦丁为标准品,在500 nm处测定吸光度,绘制标准曲线。芦丁标准曲线回归方程为Y=9.8943X+0.0021,R2=0.9994。参照芦丁标准品标准曲线,测量发酵液的吸光度,确定发酵液中黄酮含量。

1.2.3 酵母菌发酵制备葛根酵素的单因素实验

1.2.3.1 发酵时间确定 按1.2.1制备葛根液,设发酵时间为24、48、72、96、120 h,其他固定因素是:酵母菌的接种量2%,发酵初始pH4.5,发酵温度30 ℃。发酵结束后,测定发酵液中黄酮的含量。

1.2.3.2 发酵温度的确定 按1.2.1制备葛根液,设发酵温度为25、27、29、31、33 ℃,其他固定因素是:酵母菌的接种量2%,,发酵初始pH4.5,发酵时间72 h。发酵结束后,测定发酵液中黄酮的含量。

1.2.3.3 发酵液初始pH的确定 按1.3.1制备葛根液,设发酵初始pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,其他固定因素是:酵母菌的接种量2%,发酵温度30 ℃,发酵时间72 h。发酵结束后,测定发酵液中黄酮的含量。

1.2.3.4 菌种接种量的确定 按1.2.1制备葛根液,设酵母菌的接种量为1%、2%、3%、4%、5%,其他固定因素是:发酵温度30 ℃,发酵初始pH4.5,发酵时间72 h。发酵结束后,测定发酵液中黄酮的含量。

1.2.4 酵母菌发酵制备葛根酵素的工艺优化 本试验采用Box-Behnken中心组合试验设计,根据单因素试验结果分析确定因素水平,以黄酮含量为响应值,设计四因素三水平的响应面分析(Response surface methodology,RSM)试验。以发酵液中黄酮含量为响应值,采用Design-Expert软件进行响应面分析,因素和水平见表1。

表1 响应面优化实验因素水平表Table 1 Levels and factors of the response surface experiment

1.3 数据处理

采用Design-Expert.V8.0.6软件进行实验数据分析。

2 结果与分析

2.1 酵母菌发酵葛根酵素的单因素试验

2.1.1 发酵时间对葛根酵素中黄酮含量的影响 发酵时间对酵母菌发酵制备葛根酵素时,发酵液中黄酮含量的影响结果见图2。由图2可知,当发酵时间为24 h时,葛根酵素中的黄酮含量为60.13 μg/mL;当发酵时间为48 h时,葛根酵素中的黄酮含量上升到68.52 μg/mL;当发酵时间为72 h时,葛根酵素中的黄酮含量达到78.34 μg/mL;发酵时间>72 h后,葛根酵素中的黄酮含量有所下降。在发酵初期,菌种代谢促进黄酮的释放,随着发酵时间的增加释放量越多,黄酮的含量增多,但随着发酵时间延长,作用不明显,发酵液中的部分黄酮因氧化等作用被消耗,因此含量呈现下降趋势[34]。因此,酵母菌发酵葛根酵素的最佳时间为72 h。

图2 发酵时间对黄酮含量的影响Fig.2 Effects of fermentation time on flavonoid content

2.1.2 发酵温度对葛根酵素中黄酮含量的影响 发酵温度对酵母菌发酵制备葛根酵素时,发酵液中黄酮含量的影响结果见图3。由图3可知,当发酵温度为25 ℃时,葛根酵素中的黄酮含量为53.18 μg/mL;当发酵温度从25～29 ℃逐步上升,葛根酵素中的黄酮含量呈上升趋势;但发酵温度达到29 ℃时,葛根酵素中黄酮含量达到最大,为77.31 μg/mL;当发酵温度>29 ℃后,葛根酵素中黄酮含量下降。在适宜的温度范围内对酵母菌的代谢活动起到一定的促进作用,酶促反应较为活跃,有利于黄酮的释放;而当发酵温度过低或者过高都不利于酵母菌的生理代谢活动,影响其酶促反应的进行[35]。因此,29 ℃为酵母菌发酵制备葛根酵素的最佳的发酵温度。

图3 发酵温度对黄酮含量的影响Fig.3 Effects of fermentation temperature on flavonoid content

2.1.3 发酵液初始pH对葛根酵素中黄酮的含量的影响 由图4可知,酵母菌发酵的初始pH为4.0时,葛根酵素中黄酮含量为59.65 μg/mL;当初始pH逐渐增大时,葛根酵素中的黄酮含量逐渐升高;当初始pH为4.5时,葛根酵素的黄酮含量最大,为81.65 μg/mL;初始pH>4.5后,葛根酵素中的黄酮含量下降。可见酸性环境对酵母菌的生理代谢活动影响较大,在pH为4.5时,黄酮含量达到最大,偏离此值时,黄酮含量下降较为明显。实验中调节发酵液的pH至关重要,调节不当则影响实验结果。因此,酵母菌发酵制备葛根酵素的最适初始pH为4.5。

图4 发酵液初始pH对黄酮含量的影响Fig.4 Effects of initial pH on flavonoid content

2.1.4 酵母菌接种量对葛根酵素中黄铜含量的影响 由图5可以看出,当酵母菌的接种量为1%时,葛根酵素中的黄酮含量为60.13 μg/mL;酵母菌的接种量逐步上升时,葛根酵素中黄酮的含量呈上升趋势;当酵母菌的接种量为3%时,葛根酵素中黄酮含量达到79.54 μg/mL;当酵母菌接种量继续增加时,葛根酵素的黄酮含量增加幅度不大。因此,选择最佳酵母菌接种量为3%。

图5 菌种的接种量对黄酮含量的影响Fig.5 Effects of inoculation quantity on flavonoid content

2.2 酵母菌发酵制备葛根酵素的响应面优化

2.2.1 响应面回归模型的建立与分析 基于单因素实验结果分析,以黄酮含量为响应值,采取RSM法优化其发酵工艺条件,结果见表2。并利用Design-Expert对试验结果进行回归分析。

表2 响应面设计方案和试验结果Table 2 Experimental design and results of response surface

应用Design Expert进行分析,得到回归方程为:

Y=80.40-1.87A-4.51B-3.37C-1.68D-1.93AB+0.85AC+1.50AD+3.85BC+2.80BD+0.30CD-12.02A2-8.59B2-9.13C2-2.85D2

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis for the regression equation

2.2.2 响应面交互分析 根据表2设计,四个变量中任意两个变量取零水平时,其余两个变量对葛根酵素中黄酮含量影响的响应面分析图见图6。图形的坡度越陡,表明响应因素对响应指标的影响越大[36]。图6显示,发酵温度、发酵液初始pH、发酵时间、酵母接种量中任意两个变量取水平时,其余两个变量对葛根酵素中黄酮含量的影响。由图6可知,发酵温度与发酵时间、发酵时间与发酵液pH之间的交互作用对响应值的影响明显,其他因素两两交互作用对响应值的影响不明显。

图6A为发酵液初始pH为4.5、酵母接种量为3%时,发酵温度和发酵时间对酵素中黄酮含量的交互作用。可知,当发酵温度一定时,随着发酵时间的延长,黄酮含量先增大后趋于平缓。当发酵时间一定时,随着发酵温度的升高,黄酮含量先增加后下降,而且响应面显示坡度较陡,表明发酵温度与发酵时间交互作用极显著。

图6B显示,发酵温度为29 ℃、酵母接种量为3%时,发酵液初始pH和发酵时间对葛根黄酮含量的交互作用。当发酵液初始pH一定时,随着发酵时间的延长,黄酮含量增加,当发酵时间超过一定值后,黄酮含量呈下降趋势。当发酵时间一定时,随着发酵液初始pH的升高,黄酮含量呈下降趋势,响应面图坡度较陡,表明发酵液初始pH与发酵时间交互作用极显著。

图6 各因素交互作用对黄酮含量影响的响应曲面图Fig.6 Response surface plots for the effects of fermentation conditions on the flavonoid content

2.2.3 最佳条件预测及验证试验 通过Design-Expert分析,酵母菌发酵制备葛根酵素的最佳工艺为发酵时间72.16 h,发酵温度27.90 ℃、发酵液初始pH4.38、接种量2.25%,此时葛根酵素中黄酮含量的理论最大值为81.909 μg/mL。结合实际情况,将条件调整为发酵时间72 h,发酵温度28 ℃、发酵液初始pH4.5、接种量2.5%,在此条件下进行3次平行试验进行验证,黄酮含量的平均值为(81.667±0.21) μg/mL,与理论值的误差值为0.295%,说明该模型有效。

3 结论

以葛根为原材料,以酵母菌为菌种发酵制备葛根酵素,通过响应面优化发酵工艺。实验得出最佳的发酵条件为:发酵时间72 h,发酵温度28 ℃、发酵液初始pH4.5、接种量2.5%。在此条件下实际测定的黄酮含量可达到81.667 μg/mL,与模型预测值81.909 μg/mL大致相符。

目前报道中,水果类酵素制备工艺较多。葛根中含有70多种功能性化合物,特别是黄酮类化合物,具有多种药理作用。利用酵母菌发酵葛根,制备一种新型保健饮品-酵素,符合葛根资源综合利用的趋势。在制备葛根酵素的基础上,还可以结合传统中医理论和现代化的提取、分离、纯化和制剂等工艺,使我国的葛根资源优势和中医理论优势转化为技术经济优势,为我国中医现代化做出贡献。