亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与同型半胱氨酸水平的相关性

唐慧荣，马举娟，陈瑞祥

作者单位：1云南省第三人民医院药剂科，云南 昆明650011；2大理大学药学与化学学院，云南 大理671000

同型半胱氨酸（Hcy）水平升高是多种疾病发生的独立危险因素。有研究表明，Hcy水平每升高5 mmol/L，缺血性心脏病的发生风险增加32%，Hcy水平每降低3 mmol/L，缺血性心脏病的发生风险降低16%［1］；Hcy≥16 mmol/L的脑卒中病人，其病死率和复发率是Hcy正常病人的1.47倍和1.31倍［2］。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是Hcy代谢途径中的关键酶，它能够催化5，10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，为Hcy再甲基化为甲硫氨酸提供甲基，并维持体内正常的Hcy水平。当MTHFR基因发生突变，可使体内MTHFR酶活性下降，Hcy发生再甲基化途径受阻，造成Hcy在体内蓄积，进而引发高Hcy血症［3］。MTHFR C677T是目前发现MTHFR最常见的突变位点［4］，存在CC、CT、TT三种基因型，有研究表明，TT基因型可增加高Hcy血症的发病风险［5］。MTHFR C677T基因在不同国家、地区、民族的分布具有明显差异：欧洲人群的T等位基因分布较多（24.5%～43.8%），亚洲居中（2.5%～36%），非洲最低（4.9%～9.1%）［6］。因此，通过研究不同地域人群MTHFR C677T基因多态性以及与Hcy水平的相关性，将有助于该地区人群在疾病发生前后采取有效的预防和治疗措施。目前国内外关于MTHFR C677T基因多态性的地域分布以及与Hcy相关性的报道很多，但云南地区还未见有大数据的相关研究。本研究通过探讨985例云南地区人群MTHFR C677T基因分布特征及其与Hcy水平的相关性，旨在为本地区人群预防和治疗MTHFR C677T基因突变引起的高Hcy血症及其相关疾病提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2018年1月至2019年3月就诊于云南省第三人民医院并进行MTHFR C677T基因检测的985例汉族人群（包括住院病人559例、体检人群426例）作为研究对象，病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

入选标准：在该院进行MTHFR C677T基因检测并在云南省长期居住的汉族人群，研究个体间无血缘关系。排除标准：检测Hcy水平前2周曾服用或目前正在服用叶酸、B族维生素类或复合维生素药物的病人；合并肿瘤、肝、肾功能不全者；甲状腺功能异常者。

1.2方法

1.2.1分组 将所有研究对象按照基因型分为CC、CT、TT三组进行分析，并按照年龄分为青年组（＜45岁）、中年组（45～60岁）与老年组（＞60岁）；由于高Hcy血症的诊断目前还没有统一标准，因此本研究按照Hcy水平分为正常组（5～10 mmol/L），临界组（＞10～15 mmol/L），高Hcy组（＞15 mmol/L）。

1.2.2数据收集 本研究收集数据包括：①人口学数据：姓名、性别、年龄、体质量、民族、职业等；②既往病历资料：包括家族史，既往病史及现病史，用药情况（是否服用过叶酸、B族维生素类药物）；③相关实验室检查：Hcy检测结果。去除个人标识信息。

1.2.3MTHFR C677T基因多态性检测

1.2.3.1样本采集 要求受检者清晨空腹状态下（采血前一天晚餐后至第2天早上采血前禁食8～14 h），取坐位，采集肘静脉血，约3～5 mL，加至EDTA抗凝管中，并充分混匀，避免凝血或溶血，立即放置于-20℃冰箱保存，用于测定MTHFR C677T基因多态性。

1.2.3.2全血DNA提取 实验前准备：打开金属浴，设置为56℃；从2～8℃冰箱中取出核酸提取试剂盒，向缓冲液BW1中加入5 mL无水乙醇、向缓冲液BW2中加入7 mL无水乙醇，并做标记。随后进行①活化吸附柱、②裂解细胞、③洗涤。

洗脱获得DNA：取1.5 mL离心管，将吸附柱插入其中，弃去装废液的收集管，向吸附柱膜中间位置悬空滴加60 mL洗脱液BE，盖紧盖子，室温放置5 min，12 000 r/min离心2 min（DNA样本-20℃保存1个月，期间反复冻融不超过3次）。

1.2.3.3PCR-芯片杂交法检测MTHFR C677T基因型 PCR扩增：-20℃冰箱中取出试剂（扩增液，反应液A）放置室温，低速离心；将新开启的扩增液进行冰上分装（扩增液忌反复冻融）：取12个0.2 mL的PCR管，每管分装22 mL，留用实验所需数量的扩增液，其余放入-20℃冰箱保存（用于之后实验按需取出相应数量分装好的扩增液）；在PCR管盖上进行样本编号；在各扩增管中依次加入1 mL反应液A，2 mL提取好的DNA样品溶液，混匀；将各扩增管放入PCR仪中，按下列条件进行扩增：50℃5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35个循环；72℃ 5 min；取出扩增产物，2～8℃保存。

芯片杂交显色：-20℃冰箱中取出反应液B，室温解冻后，低速离心，取10 mL加入杂交缓冲液中，做好标记，在手中转动混匀；-20℃冰箱中取出抗体和抗体稀释剂，将抗体和抗体稀释剂按照1∶3 000比例混匀，12 000 r/min离心30 s，取上清液使用；从杂交显色试剂盒中取出所需数量的8联管，在8联管圆头的侧壁标注样本编号并放置于试剂架上；吸取190 mL杂交缓冲液加入其中，再加入10 mL扩增液的扩增产物，吸打混匀；加入200 mL抗体；加入200 mL显色液；-20℃冰箱中取出MTHFR基因芯片，将芯片与8联管依次放入杂交仪中，加载杂交程序，进行杂交反应。

读取结果：使用生物芯片识读仪读取结果。

1.3统计学方法运用SPSS 22.0软件进行数据处理，定量资料不服从正态分布时采用中位数（下、上四分位数）［M（P25，P75）］描述。采用χ2检验进行各基因组性别、年龄频率的比较，分析MTHFR C677T基因多态性与性别、年龄的相关性；采用Kruskal-Wallis秩和检验进行组间Hcy水平总体差异的比较，采用Games-Howell检验进行多组间的两两比较，分析MTHFR C677T基因多态性与Hcy水平的相关性；采用趋势χ2检验比较不同组间基因型分布频率随Hcy水平分层变化的趋势。P＜0.05认为差异有统计学意义。应用Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验方法检测样本的群体代表性，P＞0.05说明样本人群该基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 结果

2.1985例检测人群MTHFR C677T基因分布特征MTHFR C677T中CT基因型分布频率相对较高49.9%（492/985），CC基因型分布频率相对较低19.6%（193/985），TT基因型分布频率居中30.5%（300/985）。经检验，样本人群符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2＝0.115，P＝0.944），具有群体代表性。

2.2不同性别MTHFR C677T基因分布特征男性CC、CT、TT基因型分布频率与女性比较差异无统计学意义（χ2＝5.88，P＝0.053），见表1。

表1 不同性别汉族人群MTHFR C677T基因型频数和频率分布/例（%）

2.3不同年龄MTHFRC677T基因分布特征结果显示三种基因型在不同年龄组中分布差异无统计学意义（χ2＝4.33，P＝0.363），见表2。

表2 不同年龄汉族人群MTHFR C677T基因型频数和频率分布/例（%）

2.4MTHFR C677T基因多态性与血浆Hcy相关性

2.4.1MTHFR C677T不同基因型血浆Hcy水平比较 Hcy检出最高浓度为86.40 mmol/L，最低浓度为5.00 mmol/L，均为CT基因型。经正态性检验，血浆Hcy水平不服从正态分布，三种基因型Hcy浓度为13.50（5.55，21.45）mmol/L，CC、CT、TT基因型Hcy浓度分别为 12.30（6.73，17.87）mmol/L、12.68（7.20，18.16）mmol/L、19.04（4.11，42.19）mmol/L。经Kruskal-Wallis检验，不同基因型组间Hcy水平总体差异有统计学意义（H＝134.96，P＜0.001），采用Games-Howell检验进行组间两两比较，结果显示，TT基因型的Hcy水平高于CC和CT（P＜0.001），CC和CT基因型的Hcy水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4.2Hcy水平不同分层中MTHFR C677T基因分布特征 CC、CT基因型在Hcy水平临界组（＞10～15 mmol/L）中分布频率相对较高，TT基因型在高Hcy组（Hcy＞15 mmol/L）中分布频率相对较高，见表3。

表3 Hcy（同型半胱氨酸）水平不同分层中汉族人群MTHFR C677T基因分布特征/例（%）

3 讨论

MTHFR是Hcy代谢的关键酶，MTHFR基因突变可改变体内MTHFR氨基酸结构，使MTHFR酶活性降低，导致Hcy再甲基化受阻，Hcy水平升高，进而引发高Hcy血症。MTHFR C677T是MTHFR最常见的突变位点［4］，同时MTHFR C677T基因多态性也是乳腺癌、食管癌、胃癌等恶性肿瘤的易感基因［7-9］，《中国高血压防治指南2010》中将Hcy水平≥10 mmol/L列为心血管事件发生的独立危险因素。

Frosst等［4］在1995年首次提出MTHFR核苷酸第677位胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）替换，导致第222位氨基酸由高度保守的丙氨酸变为缬氨酸，由此突变产生了CC、CT、TT三种基因型，研究表明CT基因型可使酶活性降低35%，TT基因型可使酶活性降低70%［10］。

本研究对985例云南地区人群MTHFR C677T基因多态性进行了分析，结果显示CC型19.6%，CT型49.9%，TT型30.5%。与其他地区相比，CC基因型分布高于北方山东（14.6%）、河南（16.6%），低于天津（21.4%）、陕西（21.7%），且低于南方江苏（32.7%）、湖北（36.2%）、四川（41.8%）、云南（42.7%）、广东（51.3%）、海南（58.5%），TT基因型分布在北方地区高于天津和陕西（均为30.4%），低于山东（40.8%）、河南（37.0%），高于南方江苏（19.7%）、湖北（16.8%）、四川（13.8%）、云南（15.3%）、广东（8.3%）、海南（6.4%）［19］。上述结果表明985例云南地区人群MTHFR C677T基因多态性与其他地区相比存在地域差异性。此外，本研究中，与其他民族相比，汉族TT基因型（30.5%）分布频率较高（布依族0.84%、苗族7.45%、回族3.42%、壮族0%、维吾尔族5.26%、蒙古族15.20%［11］），表明MTHFR C677T基因多态性分布具有民族差异性，以上结论与国内外相关报道结论一致［12-15］。

在不同性别方面，大部分研究结论认为MTHFR C677T基因多态性不存在性别差异［11，16］，但也有个别研究得出相反结论。如吴自强、徐韫健［17］研究结果显示突变基因型CT、TT在女性中的分布频率（38.7%，16.1%）均高于男性（30.2%，9.8%），（P＜0.05）。本研究中CC、CT、TT基因型分布频率男性（67.4%，58.9%，65.7%）与女性（32.6%，41.1%，34.3%）差异无统计学意义（P＝0.053）。在不同年龄方面，本研究结果显示：CC、CT、TT基因型在60岁及以上人群中分布频率（47.2%，42.9%，50.0%）与在 45岁以下人群（12.9%，15.4%，14.0%）也差异无统计学意义（P＝0.363）。此结论与任玮等［18］研究结论相一致。

MTHFR C677T基因突变引起的Hcy水平升高是目前最常见的遗传因素之一，并且由MTHFR C677T基因突变引起的Hcy水平变化可增加疾病的发生风险。本研究对MTHFR C677T多态性与Hcy水平相关性进行分析，结果显示：TT基因型的Hcy水平19.04（4.11，42.19）μmol/L较高，其次为CT基因型 12.68（7.20，18.16）μmol/L，CC 型 Hcy水平较低12.30（6.73，17.87）μmol/L，TT基因型与 CC、CT 型Hcy水平差异有统计学意义。进一步对Hcy水平进行分组，结果显示：TT基因型在Hcy水平正常组（5～10 mmol/L）、临界组（＞10～15 μmol/L）以及高Hcy组（Hcy＞15 μmol/L）中的分布频率分别为 9.0%、27.3%、63.7%，TT基因型的分布频率随着Hcy水平的升高而增大。以上结果表明MTHFR C677T多态性与Hcy水平存在关联，并且TT基因型可能是发生高Hcy血症的危险因素，此结论也与国内外大部分相关研究结论一致［19-20］。