胰激肽原酶对慢性高眼压大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及机制

苏杰，杨馥宇，黄帅，田华

作者单位：1华北理工大学附属医院眼科，河北 唐山063000；2邯郸市第三医院眼科，河北 邯郸056000

青光眼是一种以视神经萎缩和视野缺损为共同特征的一种疾病，与视网膜神经节细胞（RGCs）的死亡或凋亡密切相关［1］。但RGCs死亡或凋亡的机制如何，至今仍是人们讨论的焦点，寻找一种有效防止RGCs死亡或凋亡的药物至关重要。胰激肽原酶在体内以酶原形式存在，可以作用于激肽原释放出激肽，具有扩张血管、改善血液循环、降低血压等作用［2］，还可以改善视网膜微循环，减轻视网膜缺血缺氧状态［3］，但是否可降低眼内压，延缓RGCs的凋亡？尹连荣、高健生［4］的研究表明黄芪对RGCs有保护作用，目前胰激肽原酶并无人探讨。本实验于2018年3—6月通过制作慢性高眼压模型，给予腹腔注射胰激肽原酶，研究用药后眼压的变化、RGCs的凋亡情况，以及与细胞凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）的关系，以期为青光眼的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物健康SD大鼠30只，月龄范围为2～3月，体质量范围为200～250 g，雌雄各15只，由华北理工大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（京）2014-0004，环境温度：19～22℃，湿度：50%～60%，自由饮食饮水。实验前已签署华北理工大学动物实验伦理审查表（编号：2018003）。造模前眼前节及眼底检查均未见明显异常，按随机数字表法分为三组：空白组、模型组、治疗组，每组10只。

1.2方法

1.2.1动物造模 用经典的巩膜静脉烧灼法制作慢性高眼压大鼠模型，方法：采用3%戊巴比妥腹腔注射全麻，右眼点用丙美卡因滴眼液3次，顺上方角膜缘做放射状切口，分离周边筋膜及肌肉，使用加热的弯曲针头针对颞上、颞下以及鼻上象限3条上巩膜静脉予以烧灼处理，术后0.9%氯化钠溶液冲洗。采用手持压平式眼压计监测大鼠眼压，眼压≥23 mmHg为造模成功。造模成功1周后，治疗组给予腹腔注射胰激肽原酶0.8 U（常州千红药业），药物剂量换算依据体表面积换算法得出，而空白组、模型组给予腹腔注射等剂量0.9%氯化钠溶液（0.2 mL），均每天1次，连续2周。

1.2.2RGCs苏木精-伊红（HE）染色 实验结束后手术摘除眼球，眼球标本常规石蜡包埋，制备切片，入苏木精水溶液染色，流水冲洗，70%和90%乙醇各脱水10 min，入伊红染色2 min，纯乙醇脱水，二甲苯透明，选择中性树胶封片处理，光镜下观察视网膜各层形态。

1.2.3Bcl-2、Bax免疫组化及DNA断裂的原位末端标记法（TUNEL） 制备的切片按照Bcl-2、Bax免疫组化试剂盒说明书进行操作，切片经过脱蜡，抗原修复，血清封闭，加一抗、二抗，二氨基联苯胺（DAB）显色，复染，脱水，封片。观察RGCs中各因子的表达。每只动物选取不连续的3张切片，于高倍显微镜（40倍）下选取2个视野（每个视野50 620 μm2），应用Image-pro-plus软件观察光密度（OD）值。凋亡染色同样按照TUNEL试剂盒说明书进行操作，高倍镜下观察凋亡细胞阳性细胞率。

1.3统计学方法采用SPSS 17.0数据包进行统计，实验结果以±s表示，组间整体比较进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。三组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验，P＜0.017为差异有统计学意义。

2 结果

2.1眼压分析各组造模前眼压稳定（P＞0.05）。造模后模型组与治疗组眼压均升高，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.01），治疗组用药后眼压稍有下降，但无临床意义。见表1。

表1慢性高眼压大鼠各组眼压的变化/（mmHg，±s）

表1慢性高眼压大鼠各组眼压的变化/（mmHg，±s）

注：与空白组比较，aP＜0.01

组别空白组模型组治疗组F值P值术后3周14.90±1.32 33.00±1.09a 30.09±2.52a 315.063 0.000鼠数10 10 10术前15.10±1.54 14.83±2.07 14.64±1.99 0.152 0.860术后1周15.44±1.02 32.85±2.06a 32.77±2.07a 355.429 0.000术后2周15.21±1.41 33.27±2.24a 31.68±2.20a 427.714 0.000

2.2各组大鼠视网膜HE染色情况正常大鼠的视网膜各层结构清晰，各层细胞排列规整有序。模型组可见视网膜结构有所变薄，RGCs排列不规则，分布紊乱，细胞数量减少、缺失，空泡形成。治疗组RGCs排列较规整，数量轻度减少，可见少量空泡形成。

2.3各组大鼠RGCs TUNEL染色情况正常大鼠视网膜肉眼未见TUNEL阳性细胞，模型组可见大量的TUNEL阳性细胞染色，胞核呈深棕色，治疗组也存在TUNEL阳性细胞，但数量较少且染色较浅。各组间凋亡率比较差异有统计学意义（P＜0.001），见表2。

2.4各组大鼠视网膜Bcl-2、Bax表达情况健康大鼠视网膜中存在少量的Bcl-2、Bax蛋白表达，模型组Bcl-2、Bax表达均有所增强，治疗组较模型组Bcl-2表达升高，Bax表达下降。各组因子阳性率比较差异有统计学意义（P＜0.001），见表2。

表2 各组大鼠Bcl-2、Bax的表达与视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡情况/±s

表2 各组大鼠Bcl-2、Bax的表达与视网膜神经节细胞（RGCs）凋亡情况/±s

注：Bcl-2为B细胞淋巴瘤/白血病-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白，TUNEL指DNA断裂的原位末端标记法。与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

TUNEL/%0.301±0.535 23.192±2.100a 19.638±2.595ab 796.179 0.000组别空白组模型组治疗组F值P值鼠数10 10 10 Bcl-2 0.421±0.589 15.180±3.326a 23.012±2.974ab 389.728 0.000 Bax 0.361±0.566 22.289±2.665a 17.409±2.777ab 525.331 0.000

3 讨论

青光眼是世界上主要致盲眼病之一，主要原因是视神经的不可逆损伤［5-6］，视网膜节细胞凋亡是视神经损伤的主要方式［7］，视网膜内5层仅由视网膜中央动脉（终末动脉）供血，较易发生缺血，而RGCs在缺血缺氧环境中极易受损，并且再生能力有限［8］，所以阻止或延缓RGCs的丧失是保护青光眼病人视功能的关键，抑制神经节细胞凋亡对青光眼的救治有重要价值［9］。

胰激肽原酶属于丝氨酸蛋白酶类，在生物体内以酶原形式存在。它可作用于体内激肽原释放出激肽，激肽可以松弛平滑肌，扩张微血管，提高微血管内血液流速，增加灌注，改善代谢及微循环，扩张血管的同时降低血压，胰激肽原酶还可抑制血小板聚集，防止血栓形成，增加微血管交连，有利于侧支循环建立，改善视网膜组织缺血缺氧状态等［10-11］。胰激肽原酶目前主要应用于改善糖尿病视网膜病变病人眼底微循环，青光眼病人暂无应用报道。本实验通过制作大鼠慢性高眼压模型，腹腔注射胰激肽原酶，研究结果显示：胰激肽原酶腹腔注射后，治疗组眼压较模型组有所降低，但未达到正常范围（10～21 mmHg），眼压无明显临床意义，眼压下降原因考虑可能为激肽作用于血管壁，扩张房水静脉，导致房水引流增多所致。但下降的眼压是否对保护RGCs有所帮助，需进一步研究证实。

正常视网膜各细胞层结构清晰，细胞排列有序。本实验HE染色显示：模型组RGCs排列稀疏、紊乱，细胞变性、凋亡，数量减少，空泡形成较多，而治疗组用药后RGCs形态明显改善，损伤较轻，空泡细胞减少，说明胰激肽原酶腹腔注射后可以有效保护RGCs，修复损伤。

有研究表明，RGCs的凋亡受到多种基因调控，而Bcl-2、Bax对RGCs的凋亡起主要调控作用［12］。Bcl-2蛋白可以与一些细胞凋亡相关细胞结合，影响这些细胞的传导通路最终达到抑制凋亡的目的［13］。它是一种抗细胞凋亡基因，可抑制细胞的凋亡，而Bax是促凋亡蛋白，与Bcl-2结合后封闭其活性，导致细胞凋亡［14］。免疫组化实验结果显示：模型组与治疗组较空白组Bcl-2、Bax表达均增多，胰激肽原酶腹腔注射2周后，与模型组相比，治疗组Bcl-2表达增加，Bax表达减少，差异有统计学意义，说明胰激肽原酶可以上调抗细胞凋亡因子Bcl-2的表达，下调Bax促细胞凋亡因子的表达，从而实现抗细胞凋亡，因此，胰激肽原酶通过调控Bcl-2、Bax的表达可以达到保护RGCs的目的。

有研究表明，青光眼不管损伤机制是如何形成和发展，最后的结局即RGCs的凋亡，可应用TUNEL技术来测定细胞凋亡的情况［15］。TUNEL染色是常用的观察凋亡的实验方法，正常大鼠RGCs层偶见凋亡细胞，本实验结果显示：空白组未见明显凋亡细胞，模型组较治疗组凋亡细胞增多，组间比较差异均有统计学意义，提示眼压升高后可导致RGCs发生凋亡坏死，而胰激肽原酶腹腔注射对RGCs具有保护作用，减少凋亡。

综上所述，胰激肽原酶可以改善视网膜微循环，轻度降低眼压，上调促凋亡因子Bcl-2，下调凋亡因子Bax的表达，抑制RGCs凋亡，达到保护视经节细胞的目的，为青光眼的进一步治疗提供理论依据。