苯丁酸钠对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

郭浩，周淑妮，冉瑞智

作者单位：恩施土家族苗族自治州中心医院，

a肿瘤内科，

b中医心血管内科，湖北 恩施445000

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一，在我国乳腺癌的年龄标准化发病率为30.69/10万，位居女性恶性肿瘤的首位，居癌症相关死因的第5位，我国乳腺癌病人发病年龄多在45～55岁，近些年乳腺癌发病也有明显的年轻化趋势，目前手术、化疗、放疗、内分泌及生物治疗等为主的综合治疗是乳腺癌标准的治疗方法，乳腺癌及其治疗损伤给女性病人心理健康和生活质量带来了严重的影响，乳腺癌的临床治疗疗效仍有待进一步提高［1-2］。

苯丁酸钠（Sodium phenylbutyrate，NaPB）属于苯丁酸盐及其衍生物的一种，NaPB可通过抑制DNA修复、诱导细胞凋亡和细胞周期停滞等机制抑制多

种肿瘤细胞的生长和增殖［3］，有研究提示苯丁酸盐抗肿瘤作用可能与乳腺癌易感基因1（Breast cancer gene 1，BRCA1）有关［4］。BRCA1是一种抑癌基因，其编码的BRCA1蛋白在乳腺癌的发病、预防、治疗及预后中起到了重要作用［5］。NaPB对乳腺癌细胞生长增殖的影响及其作用机制尚无确切结论，本实验于2018年10月至2019年1月以MDA-MB-231细胞为研究对象，探讨NaPB对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响，同时通过分析NaPB对BRCA1蛋白表达的影响初步探究其作用机制。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞株购自中国医学科学院上海生物研究所细胞资源中心。NaPB（上海金锦乐实业有限公司生产，批号20171105），溶解于双蒸水中使用［6］。胎牛血清、DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶均购于美国Gibco Life Technologies公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液（美国Sigma公司生产，型号规格：M2128-100MG，批号20180212）。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）双染法细胞凋亡检测试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司生产，批号20180503）。BRCA1抗体（型号ab213929）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗体（型号ab32124）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体（型号ab32503）、β-肌动蛋白（β-actin）抗体（型号ab8226）、过氧化物酶标记山羊抗兔二抗和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗均购于艾博抗（上海）贸易有限公司。

1.2细胞培养技术将人乳腺癌细胞系MDA-MB-231接种于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，培养基中加入100 U/mL青霉素和100 mg/L的链霉素，细胞维持培养于37℃、含有5%的二氧化碳、95%湿度的培养箱中，隔天换液，用0.25%的胰蛋白酶消化传代后，离心制成单细胞悬液以备NaPB处理、增殖能力检测、蛋白质印迹法等后续实验。

1.3四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测细胞增殖活力取处于对数生长期的MDAMB-231细胞接种于96孔板中（细胞浓度5.0×104/mL），过夜培养后加入不同剂量的NaPB（0 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L）处理24 h、48 h和72 h后进行实验。每组设置5个复孔，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37℃孵育4 h后终止培养。弃上清后每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解MTT结晶，摇床震荡混匀10 min，然后在酶标仪上选择490 nm波长，最后测定各孔的光密度（OD）值。MTT法得到各组细胞培养孔中OD值的复孔平均值。细胞增殖存活率＝（实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%，实验检测重复3次。

1.4流式细胞仪检测细胞凋亡将处于对数生长期的MDA-MB-231细胞以1.0×105密度接种于6孔板上，于培养体系中与药物共同孵育48 h后，1 500 r/min离心5 min，收集细胞，加入孵育缓冲液洗涤，离心，去上清液，使用500 μL上样缓冲液（Binding buffer）悬浮细胞，然后再进行荧光标记，先加入5 μL Annexin V-FITC，后加入5 μL PI荧光标记溶液，轻轻混匀，室温下避光孵育20 min，于1 h内使用流式细胞仪进行检测。

1.5蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和BRCA1蛋白的表达收集实验各组细胞，根据蛋白提取试剂盒操作说明于冰上裂解提取各组细胞的目标总蛋白，按照BCA蛋白质定量试剂盒操作说明进行实验，测定各组细胞的目标蛋白质的浓度，然后经灌胶、上样处理后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离各组蛋白质，应用湿转法将分离的蛋白条带转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），封闭后并分别与抗人Bcl-2、Bax、BRCA1和β-actin一抗置4℃水平摇动过夜，再加入与辣根过氧化物酶标记的二抗反应，洗膜、风干后使用辣根过氧化物酶（HRP）-增强化学发光法（ECL）进行显影，使用β-actin作为内参进行相对含量的计算和分析。

1.6统计学方法应用SPSS 20.0软件包进行统计学数据的整理和分析。实验中计量数据均以±s表示，多组样本均数的比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用Bonferroni校正法，P＜0.05（两两比较时P＜0.016 7）表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1NaPB对MDA-MB-231细胞增殖活力的影响实验根据NaPB的剂量（0 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L）不同将乳腺癌MDA-MB-231细胞分为对照组（0 mmol/L NaPB组），2 mmol/L NaPB组4 mmol/L NaPB组。MTT实验结果表明NaPB作用于MDAMB-231细胞24 h后，对照组、2 mmol/L NaPB组4 mmol/L NaPB组细胞生存率分别为（100.00±0.00）%、（82.05±7.11）%和（67.46±4.77）%，三组间比较差异有统计学意义（F＝32.174，P＜0.001）；48 h后，对照组、2 mmol/L NaPB组4 mmol/L NaPB组细胞生存率分别为（100.00±0.00）%、（74.33±4.46）%和（58.75±5.12）%，三组间比较差异有统计学意义（F＝82.864，P＜0.001）；72 h后，对照组、2 mmol/L NaPB组4 mmol/L NaPB组细胞生存率分别为（100.00±0.00）%、（70.63±4.26）%和（48.98±3.59）%，三组间比较差异有统计学意义（F＝184.127，P＜0.001）。该结果提示NaPB可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖活力，且随着剂量的增加其抑制作用有增加的趋势。

2.2NaPB对MDA-MB-231细胞凋亡的影响流式细胞学检测MDA-MB-231细胞凋亡结果（图1A）表明，对照组、2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组细胞的凋亡率分别为（4.25±0.89）%、（14.11±2.98）%和（32.73±1.89）%，三组比较差异有统计学意义（F＝166.668，P＜0.001）；两两比较采用Bonferroni校正法，2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组细胞凋亡率均明显低于对照组（P＝0.002；P＜0.001）；2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组比较差异有统计学意义（P＜0.001）。

应用蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2的表达水平结果表明，对照组、2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组Bcl-2蛋白相对灰度值分别为（0.78±0.02）、（0.58±0.04）和（0.39±0.02），三组比较差异有统计学意义（F＝162.437，P＜0.001）；与对照组相比，2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组Bcl-2的表达均有明显降低（P＜0.001；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB组Bcl-2的表达低于2 mmol/L NaPB组（P＜0.001）。凋亡相关蛋白Bax的相对灰度值对照组、2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组分别为（0.26±0.02）、（0.41±0.02）和（0.69±0.04），三组比较差异有统计学意义（F＝210.437，P＜0.001）；与对照组相比，2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组Bax的表达均有明显增加（P＝0.001；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB组Bax的表达高于2 mmol/L NaPB组（P＜0.001）。各组Bcl-2和Bax蛋白质印迹法结果见图1B。以上数据提示NaPB可诱导乳腺癌细胞凋亡，且剂量越高诱导作用越明显。

2.3NaPB对MDA-MB-231细胞BRCA1蛋白表达的影响蛋白质印迹法检测结果表明，应用NaPB后MDA-MB-231细胞BRCA1的表达量显著降低（图2），对照组、2 mmol/L NaPB组和4 mmol/L NaPB组Bcl-2蛋白相对灰度值分别为（0.83±0.03）、（0.61±0.05）和（0.30±0.04），三组比较差异有统计学意义（F＝117.348，P＜0.001）；2 mmol/L NaPB 组和4 mmol/L NaPB组BRCA1的表达均明显高于对照组（P＝0.002；P＜0.001）；4 mmol/L NaPB组BRCA1表达高于2 mmol/L NaPB组（P＜0.001）。以上数据表明NaPB可抑制乳腺癌细胞中BRCA1的表达，且高剂量抑制作用更明显。

3 讨论

化疗与手术、放疗并称为恶性肿瘤的三大治疗方法，乳腺癌通过化疗可以达到临床治愈或者长期生存的效果，探索新的有效的治疗乳腺癌的药物具有重要临床意义［7］。

作为一种氨清除剂，在人体内，苯丁酸盐被氧化成苯乙酸盐，再与谷氨酰胺结合以苯乙酰谷氨酰胺的形式从尿中排出，从而介导废物氮的清除，目前是治疗尿素循环障碍和高氨血症的常用药物。然而，体外和体内研究均证明苯丁酸盐及其衍生物具有明显的抗肿瘤作用，其作用包括抑制肿瘤生长、侵袭和迁移，并在不同类型的实体瘤（如舌癌、恶性胶质瘤、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等）以及血液肿瘤（如急性髓性白血病）中诱导细胞分化和凋亡［6，8-10］。苯丁酸盐及其衍生物抗肿瘤作用的可能机制总结如下：抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，诱导分化，抑制血管生成，抑制DNA修复，抑制肿瘤细胞转移以及免疫调节作用。此外，苯丁酸盐及其衍生物的抗肿瘤作用还具有剂量依赖性和细胞类型选择性，因此需要进行针对不用类型的肿瘤进行实验研究以验证其作用［3］。

目前尚不完全清楚NaPB在乳腺癌中的抗瘤作用，本研究通过细胞实验初步探究了NaPB在乳腺癌药物治疗上的潜在应用价值。结果表明NaPB能显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活力，并可诱导其凋亡，NaPB可诱导凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平下降和Bax表达水平升高，NaPB的抗肿瘤作用在高剂量组中表现得更明显。与本实验的研究结果相似，孙象军等［11-12］的研究表明NaPB可有效地抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖活力，且该作用具有剂量-时间依赖性，其作用机制可能与NaPB上调HOXA5基因mRNA表达水平影响乳腺癌细胞的转录过程有关。研究人员还就NaPB对乳腺癌细胞超微结构的影响进行了深入的研究，结果发现应用NaPB后可引起乳腺癌细胞形态发生显著改变，主要表现在诱导MCF-7细胞向成熟表型方向分化，降低其恶性程度，同时，NaPB可导致乳腺癌细胞周期发生G0/G1期阻滞，影响乳腺癌细胞DNA的合成。另外，还有研究发现NaPB可以显著抑制HER2阳性的乳腺癌SKBR3细胞的增殖并诱导SKBR3细胞凋亡，同时，NaPB可增加抗HER2受体的单克隆抗体曲妥珠单抗治疗的敏感性，NaPB的这种作用与p27Kip1蛋白的表达增加有关［13］，但是上述NaPB的作用在HER2阴性的乳腺癌HCC1937细胞中不存在，其原因可能与苯丁酸盐抗的癌作用具有细胞类型选择性有关。

BRCA1基因编码的蛋白可作用于DNA损伤修复、细胞增殖与凋亡、基因转录调控和细胞周期调节等多种细胞生命活动过程。BRCA1蛋白的表达水平与乳腺癌的预后及对化疗药物敏感性的影响尚未明确，现有的研究结果也不一致［5，14-16］。本实验发现NaPB可明显降低乳腺癌细胞BRCA1蛋白的表达水平，该结果提示NaPB可能通过调节BRCA蛋白水平发挥抗癌作用。类似的，有研究发现在头颈部恶性肿瘤细胞中，苯丁酸盐可通过降低BRCA1蛋白表达抑制肿瘤细胞的DNA损伤性修复，从而增强了细胞对顺铂的敏感性［4］。但是，有研究表明miR-185可以通过上调BRCA1的表达抑制三阴乳腺癌细胞的增殖与侵袭［17］，分析其原因可能是BRCA1蛋白在不同药物中的作用机制不同造成的。BRCA1蛋白可通过同源重组参与DNA双链的损伤性修复，研究表明BRCA1基因突变的乳腺癌病人由于BRCA1蛋白表达量降低，造成了同源重组修复功能缺陷，可能对顺铂、卡铂和多聚聚合酶（PARP）抑制剂等DNA损伤药物更为敏感［18-19］，而紫杉醇诱导的乳腺癌细胞的凋亡需要BRCA1蛋白参与，故BRCA1基因突变可诱导肿瘤细胞对紫杉醇耐药，此外，BRCAl对肿瘤细胞的凋亡也具有不同调节功能［20］。

综上所述，NaPB可抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞生长增殖和诱导细胞凋亡，NaPB可显著降低乳腺癌细胞BRCA1蛋白表达水平，该结果提示NaPB可能通过调节BRCA1蛋白水平影响DNA损伤修复，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用，这也是NaPB抗肿瘤的机制之一，NaPB介导的BRCA1途径有望成为乳腺癌治疗的作用靶点，该结论有待进一步的研究以明确。

（本文图1，2见插图6-3）

图1 苯丁酸钠（NaPB）对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡的影响：A为流式细胞仪检查MDA-MB-231细胞各组凋亡情况；B为蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达水平

图2 苯丁酸钠（NaPB）对乳腺癌MDA-MB-231细胞BRCA1（乳腺癌易感基因1）蛋白表达的影响