阿托伐他汀联合葛根素对激素性股骨头缺血性坏死的作用机制研究

胡彦婷，汪瑜，熊德建，黄歆，杨云戟，罗梅懿，张霞

作者单位：1成都市第七人民医院，a骨科，b护理部，四川 成都610041；

2四川省医学科学院、四川省人民医院特需门诊，四川 成都610072

股骨头缺血性坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一种常见骨科疾病，致残率极高。导致ONFH的病因较多，而激素性股骨头缺血性坏死（SANFH）最为常见，占总发病率的57%［1］。SANFH与成骨细胞及破骨细胞的分化和凋亡密切相关，但具体机制仍不明确。近年来有研究发现，骨保护蛋白/核因子-κB受体活化因子配基/核因子-κB受体活化因子（OPG/RANKL/RANK）信号通路能够调控破骨细胞的分化、增殖和凋亡，在SANFH中发挥重要作用［2］。

阿托伐他汀是传统降脂药［3］。有研究发现阿托伐他汀能够通过调控基质金属蛋白酶（MMPs）/基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）系统，改善醋酸泼尼松龙诱导的大鼠激素性股骨头坏死［4］。葛根素是从中药葛根中提取分离的一种单体，具有提高免疫、保护血管内皮细胞、抗肿瘤和抗氧化等多种药理活性，被广泛应用于临床［5］。本研究于2018年8—10月通过探究阿托伐他汀联合葛根素对SANFH模型大鼠的治疗效果及可能的作用机制，为临床治疗SANFH提供新方法和新思路。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 50只SD雄性大鼠，12周龄，体质量范围为400～450 g，购于成都达硕生物科技有限公司，医学实验动物合格证号：20190078，使用许可证号：SYXK（川）2018-119。适应性喂养1周后进行实验。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2主要试剂及药物 总RNA提取试剂盒，购于索莱宝生物公司（中国）；PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTMII试剂盒购于TaKaRa公司（中国）；RANK、RANKL、OPG和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF-6）抗体及对应二抗购于Abcam公司（美国）；大鼠酶联免疫吸附剂测定（ELISA）试剂盒购于上海鑫乐生物科技有限公司（中国）；RANK、RANKL和β-肌动蛋白（β-actin）引物由上海生物工程股份有限公司合成。葛根素和脂多糖购于Sigma公司（美国）；阿托伐他汀和甲强龙，购于辉瑞公司（美国）；DNA断裂的原位末端标记（TUNEL）凋亡试剂盒购于碧云天生物公司（中国）。

1.1.3主要仪器 台式低速离心机（TDZ4-WS）购于长沙湘仪离心机仪器有限公司（中国）；酶标仪购于赛默飞世尔仪器有限公司（中国）；实时荧光定量PCR（qPCR）仪购于Thermo Fisher公司（美国）；全自动组织脱水机（TSJ-Ⅱ）购于常州中威电子仪器有限公司（中国）。

1.2方法

1.2.1SANFH模型的建立 50只SD雄性大鼠采用随机数字表法分为五组，分别为空白组、模型组、阿托伐他汀组、葛根素组、联合用药组，每组10只。模型组及药物组大鼠腹腔注射20 μg/kg脂多糖2次，两侧臀肌注射40 mg/kg甲强龙3次，所有药物每次间隔24 h。脂多糖末次注射结束后，将葛根素（400 mg/kg）和阿托伐他汀（20 mg/kg）灌胃给予相应组别大鼠，每天1次，连续8周。

1.2.2ELISA检测血清中碱性磷酸酶（ALP）和转化生长因子β1（TGF-β1） 给药结束后，采集各组大鼠血液，3 000 r/min离心收集血清，参照ELISA试剂盒说明书检测各组ALP和TGF-β1的含量。

1.2.3组织病理学检测 给药结束后，取各组大鼠股骨头组织，部分固定于多聚甲醛，部分保存于液氮中。多聚甲醛固定7 d后进行脱水脱钙处理，二甲苯透明，常规石蜡包埋和切片。部分切片用苏木精-伊红（HE）进行染色，观察股骨头组织病理变化。

1.2.4细胞凋亡染色观察 取部分切片用TUNEL凋亡试剂盒进行染色。细胞核为棕黄色即是阳性。

1.2.5qPCR检测 使用总RNA提取试剂提取大鼠股骨头组织总RNA，使用逆转录试剂盒PrimeScript™RT reagent Kit进行逆转录，制备互补DNA（cDNA），各cDNA样品分别用相应引物进行PCR反应，引物序列见表1。反应体系12.5 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 6.25 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、双蒸水4.25 μL、cDNA 1 μL。反应条件为：95 ℃预变性 3 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环。以β-actin mRNA水平作为内参。以2-ΔΔCt法计算股骨头组织RANK和RANKL mRNA表达情况。

表1 实时荧光定量PCR（qPCR）反应引物序列

1.2.6蛋白质印迹法（Western Blot）检测 取同侧股骨头低温研磨，用RIPA裂解液低温提取总蛋白，BCA法测定总蛋白量。每4微升蛋白质样品加入1 μL十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液（5×）的比例，混合蛋白质样品和缓冲液，煮沸5 min，样品于-20°C保存备用。使用等量蛋白质上样，选择10%的SDS-PAGE进行分离，分离后的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用5%的脱脂奶粉封闭1 h，封闭结束后结合一抗（OPG、RANK、RANKL、TRAF-6和β-actin均按1∶400稀释），4℃孵育过夜后等渗缓冲盐溶液（TBST）清洗，然后二抗IgG（稀释比例均为1∶5 000）室温孵育1 h，TBST清洗，化学发光试剂ECL暗室显色。显色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系统采集图像，Image-ProPlus分析光密度，以β-actin为内参，计算大鼠股骨头组织中OPG、RANK、RANKL、TRAF-6蛋白相对表达量。

1.3统计学方法用SPSS 20.0分析，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠血清中ALP和TGF-β1比较结果与空白组比较，模型组大鼠血清中ALP含量升高（P＜0.01），TGF-β1含量降低（P＜0.01）；与模型组比较，三个药物组大鼠血清中ALP均降低，其中阿托伐他汀组和联合用药组差异有统计学意义（P＜0.05）；三个药物组TGF-β1均增加，其中联合用药组差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

2.2组织病理观察结果各组大鼠股骨头HE染色结果如图1所示。空白组可见骨膜光滑，软骨细胞排列整齐，骨小梁完整，骨小梁中的骨细胞清晰，骨髓中造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少，形态正常；模型组骨小梁、骨细胞、软骨下血管、造血细胞数量均减少，脂肪细胞体积增大，血管减少；阿托伐汀组、葛根素组与联合用药组均有明显改善，其中，联合用药组的软骨细胞排列整齐，骨小梁致密，骨细胞排列整齐均匀，骨髓腔内有大量造血细胞，脂肪细胞分布均匀，血管较多。

表2 各组大鼠血清中的相关因子/±s

表2 各组大鼠血清中的相关因子/±s

注：ALP为碱性磷酸酶，TGF-β1为转化生长因子β1。与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

TGF-β1/（ng/mL）47.12±2.41 37.74±2.68a 39.84±2.98 39.23±3.47 44.12±2.42b 19.030＜0.001组别空白组模型组阿托伐他汀组葛根素组联合用药组F值P值鼠数10 10 10 10 10 ALP/（IU/L）25.23±1.24 31.86±1.23a 29.09±1.37b 30.75±2.07 26.96±1.54b 31.827＜0.001

2.3TUNEL法检测细胞凋亡情况TUNEL法染色结果如图2所示，空白组骨小梁和骨髓中凋亡率为（1.06±0.14）%；模型组骨小梁和髓腔内均可见大量阳性细胞，凋亡率为（22.37±3.71）%，阿托伐他汀组、葛根素组和联合用药组骨小梁和骨髓中也可见阳性细胞，但均明显少于模型组，凋亡率分别为（8.22±1.41）%、（11.41±1.72）%和（4.01±0.68）%（F＝88.434，P＜0.001）。与空白组相比，模型组大鼠的细胞凋亡指数明显升高；与模型组相比，三个药物组的细胞凋亡指数均降低（均P＜0.001），其中联合用药组的凋亡指数变化最明显。

2.4qPCR检测结果与空白组相比，模型组、阿托伐他汀组和葛根素组大鼠的RANKL mRNA表达量均升高（P＜0.01），RANK mRNA表达量降低（P＜0.01或P＜0.05）。与模型组相比，联合用药组大鼠的 RANKL mRNA表达量降低（P＜0.01），RANK mRNA表达量升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠股骨头组织中相关基因的表达量/± s

表3 各组大鼠股骨头组织中相关基因的表达量/± s

注：RANKL为核因子-κB受体活化因子配基，RANK为核因子-κB受体活化因子。与空白组比较，aP＜0.01，cP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.01，dP＜0.05

RANK 1.00±0.08 0.53±0.03a 0.63±0.07a 0.66±0.27c 0.78±0.08d 5.552 0.013组别空白组模型组阿托伐他汀组葛根素组联合用药组F值P值鼠数10 10 10 10 10 RANKL 1.00±0.08 1.92±0.34a 1.70±0.11a 1.65±0.20a 1.20±0.14b 11.336＜0.001

2.5蛋白质印迹法检测结果蛋白质印迹法检测结果如图3和表4所示，与空白组相比，模型组、阿托伐他汀组、葛根素组和联合用药组大鼠股骨组织中OPG表达量均降低（P＜0.01）；模型组、阿托伐他汀组、葛根素组大鼠股骨组织RANK表达量均降低（P＜0.01），而RANKL表达量和TRAF-6蛋白表达量均升高（P＜0.01）；同模型组相比，三个药物组大鼠股骨组织中OPG和RANK含量升高（P＜0.01），RANKL和TRAF-6降低，且联合用药组变化最明显。

图3 各组大鼠股骨头中相关蛋白表达情况（蛋白质印迹法）：A为空白组，B为模型组，C为阿托伐他汀组，D为葛根素组，E为联合用药组

表4 各组大鼠股骨头组织中相关蛋白含量/±s

表4 各组大鼠股骨头组织中相关蛋白含量/±s

注：OPG为骨保护蛋白，RANK为核因子-κB受体活化因子，RANKL为核因子-κB受体活化因子配基，TRAF-6为肿瘤坏死因子受体相关因子6。与空白组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

TRAF-6 1.00±0.04 1.82±0.05a 1.67±0.05a 1.59±0.24ab 1.14±0.10c 25.096＜0.001组别空白组模型组阿托伐他汀组葛根素组联合用药组F值P值鼠数10 10 10 10 10 OPG 0.95±0.06 0.54±0.02a 0.64±0.04ab 0.64±0.02ab 0.84±0.05ac 55.969＜0.001 RANK 0.99±0.04 0.56±0.08a 0.71±0.02ac 0.75±0.05ac 0.92±0.06c 29.214＜0.001 RANKL 1.04±0.07 1.64±0.05a 1.42±0.07ac 1.41±0.05ac 1.18±0.13c 25.269＜0.001

3 讨论

脂肪代谢紊乱、血管内凝血、骨质疏松等多种因素都会导致SANFH。近些年来随着糖皮质等激素治疗在临床上多种疾病中的广泛应用，SANFH发病率大增，已居非创伤性股骨头坏死首位。关节置换技术往往导致病人产生较大的痛苦，加之费用昂贵，因此，采用药物干预进行保股骨头的治疗方法依然是治疗SANFH的首选。

阿托伐他汀是三羟基三甲基辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，因具有较好的降脂和抗凝效果被广泛应用于临床［6］。葛根素是一种黄酮类药物。邓银栓等［7］研究发现，葛根素能够刺激成骨细胞的增殖，提高成骨细胞的分化早期标志物ALP的活性。阿托伐他汀和葛根素分别单独使用都具有治疗SANFH的作用，两种药物联合使用也被用于治疗糖尿病肾病、不稳定性心绞痛、冠心病和颈动脉粥样硬化等疾病，但阿托伐他汀联合葛根素能否增强其对SANFH的治疗效果，目前还没有被报道。

ALP能够水解有机磷酸酯，破坏钙化抑制剂，参与了调节成骨细胞的增殖、分化及迁移，是成骨细胞早期分化的标记基因［8］。TGF-β1是一种多功能蛋白多肽类生长因子，能刺激成骨细胞增殖、分化，促进骨形成，并且可抑制骨吸收，是参与骨代谢过程中最重要的细胞因子［9］。本研究首先用脂多糖联合甲强龙建立了大鼠SANFH模型，并分别用阿托伐他汀和葛根素进行单独和联合治疗，发现模型组大鼠血清中ALP明显升高，TGF-β1降低。HE染色发现模型组大鼠骨小梁、软骨细胞和软骨下血管均减少，脂肪细胞体积增大。TUNEL法染色发现模型组骨小梁和髓腔内可见大量凋亡细胞，表明成功建立了SANFH大鼠模型。阿托伐他汀和葛根素分别单独用药治疗结果与彭小明等［10-11］报道的相一致。与模型组相比，联合用药组ALP、TGF-β1及凋亡指数均有变化，HE染色结果显示大鼠软骨细胞排列整齐，骨小梁致密，骨髓腔内有大量造血细胞，脂肪细胞大小及分布较正常，表明阿托伐他汀联合葛根素组治疗效果最好，可以用于临床SANFH的治疗。

OPG/RANKL/RANK通路与骨质疏松等骨科疾病联系紧密，能直接影响破骨细胞的增殖、分化及其功能［12-14］。OPG能够抑制破骨及其前体细胞的增殖和活化，减少骨吸收，诱导破骨细胞凋亡。RANKL具有诱导破骨细胞分化、发育、发挥功能的因子。RANK是RANKL的唯一受体［14-15］。OPG和RANK竞争性结合RANKL。RNAK的尾端上有肿瘤坏死因子受体（TNFR）相关因子（TNF receptor associated factors，TRAFs）结合位点，其中以TRAF-6为主。当RANKL-RANK配体受体结合后，TRAF-6与RANKL尾部结合，进而促进破骨细胞的增殖、分化、成熟及激活骨细胞活性［16-19］。本研究结果发现与空白组相比，模型组大鼠OPG和RANK升高，RANKL和TRAF-6降低，进一步证明了OPG/RANKL/RANK信号通路在SANFH中被调控。阿托伐他汀和葛根素能够下调大鼠股骨组织中OPG和RANK的表达，上调RANKL和TRAF-6的表达。且联合用药组变化最明显，与模型组相比，均差异有统计学意义，表明阿托伐他汀联合葛根素可能是通过调控OPG/RANKL/RANK信号通路治疗大鼠股骨头坏死。

综上，阿托伐他汀联合葛根素对SANFH模型大鼠有治疗作用，治疗效果强于两种药物单独使用时的效果，其作用机制可能是通过调控SANFH模型大鼠OPG/RANKL/RANK信号通路而实现的。

（本文图1，2见插图6-1）

图1 各组大鼠股骨头HE（苏木精-伊红）染色结果（×100）：A为空白组；B为模型组；C为阿托伐汀组；D为葛根素组；E为联合用药组

图2 各组大鼠股骨头TUNEL法（DNA断裂的原位末端标记法）染色结果（×400）：A为空白组；B为模型组；C为阿托伐汀组；D为葛根素组；E为联合用药组