肿瘤坏死因子受体相关因子6的表达对食管鳞状细胞癌预后的影响

杨兰艳，殷芳，王建刚，孔娜

作者单位：云南省第三人民医院消化内科，云南 昆明650000

食管癌是最常见的消化道恶性肿瘤，其预后不良，居全球癌症相关死因第6位［1］。西方国家大多数食管癌病理类型为腺癌，而在我国则以鳞状细胞癌居多。随着以手术治疗为主、化疗和放疗为辅的综合治疗措施的出现，食管癌病人的生存率有所提高，但其5年总生存率仍然较低［2］。肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）是一种新型天冬酰胺基内肽酶蛋白酶，具有促进蛋白质稳定的作用［3］，最近的研究表明TRAF6与多种肿瘤的发生发展相关［4-6］。然而国内尚未发现TRAF6与食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）复发和生存的相关性研究。本研究通过检测TRAF6在ESCC组织中的表达及其与生存和复发的相关性，以期为ESCC的治疗和预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2012年12月至2014年2月在云南省第三人民医院接受根治性切除术治疗的经病理证实为ESCC的病人作为研究对象。共有478例ESCC病人纳入本研究，年龄（59.3±7.6）岁，年龄范围为44～75岁。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求，所有研究对象在参与本研究前均已签署知情同意书。

1.2免疫组织化学及阳性判断标准采用10%甲醛对术中切除的新鲜的食管癌组织标本进行固定，并行常规石蜡包埋，将石蜡标本切成4 μm连续切片，60℃烤片8 h备用。将切片脱蜡和水化。采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗3次，每次3 min。蒸馏水浸泡后行抗原修复。采用PBS 100℃修复10 min。并自然冷却至室温。在PBS摇床上进行2～3次冲洗，每次5 min。然后滴入过氧化氢酶阻断溶液，室温下孵育10 min；滴加生物素标记二抗（羊抗兔IgG），室温下孵育1 h；PBS冲洗3次，每次3 min；行DNA染色，蒸馏水冲洗后，使用苏木素复染，酒精脱水，采用流水进行缓慢冲洗反蓝，空气干燥，中性胶封片。

由2名高级职称病理科医师对免疫结果进行判定［7］：在高倍镜下，每张切片观察15个视野。平均100个细胞中TRAF6阳性细胞的个数为阳性细胞率。细胞质中观察到棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞染色程度评分标准为0分：阴性；1分：淡黄色；2分：黄色；3分：棕黄色。阳性细胞百分比评分标准：0分：＜1%；1分：1%～10%；2分：＞10%～30%；3分：＞30%～60%；4分：＞60%。最终得分为细胞质阳性细胞染色程度评分与阳性细胞百分比评分之和。最终结果判定：0～2分：阴性，3～7分：阳性。

1.3随访采用电话随访和门诊随访相结合的方式，病人出院后每3个月随访1次，了解病人术后复发和生存状况等信息，随访截止日期为2019年5月。478例ESCC病人中，445例完成随访，失访23例，随访率95.2%。中位随访时间为33个月（范围为5～60个月）。

1.4统计学方法采用SPSS 22.0进行统计分析。连续资料用x±s表示。分类资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。用Kaplan-Meier并Log-rank检验进行单因素生存分析，单因素分析差异有统计学意义的变量纳入Cox多因素模型分析影响ESCC病人复发和死亡的独立危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TRAF6表达与ESCC病人临床病例特征的关系478例ESCC病人中，341例（71.3%）符合TRAF6表达阳性标准。TRAF6阳性表达癌组织细胞质呈淡黄色、棕黄色或棕褐色，见图1。TRAF6表达与性别、年龄、肿瘤大小无关（P＞0.05）。TRAF6表达与ESCC病人的TNM分期、淋巴结转移、复发和死亡状况显著相关（P＜0.001）。淋巴结转移、较高临床分期、发生复发或死亡的病人TRAF6阳性表达率高。见表1。

表1 肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）表达与食管鳞状细胞癌临床病例特征的关系/例（%）

2.2ESCC病人单因素生存分析Kaplan-Meier并Log-rank检验显示，较高TNM分期、淋巴结转移、TRAF6阳性表达可增加ESCC病人复发风险（P＜0.001）。较高TNM分期、淋巴结转移、复发、TRAF6阳性表达可增加ESCC病人死亡风险（P＜0.001）。结果见表2，图2。

2.3ESCC病人多因素Cox回归分析结果将Kaplan-Meier并Log-rank分析结果显示差异有统计学意义的变量纳入Cox回归模型，结果显示：较高TNM分期、淋巴结转移、TRAF6阳性表达是ESCC病人复发的独立危险因素（P＜0.001）。较高TNM分期、淋巴结转移、复发、TRAF6阳性表达是ESCC病人死亡的独立危险因素（P＜0.001）。见表3。

表2 食管鳞状细胞癌445例单因素生存分析

表3 食管鳞状细胞癌445例多因素生存分析

3 讨论

近年来，虽然ESCC的治疗技术取得了突破性的进展，然而其总体生存率并没有得到显著改善。ESCC具有家族聚集性的临床特征，表明遗传易感性可能在食管癌发生发展中起关键作用［8］。然而，由于肿瘤的异质性，具有相似临床特征的ESCC病人预后也可能不同。因此，鉴定新的敏感和特异性分子标志物对于ESCC的早期诊断和治疗非常重要。TRAF6是肿瘤坏死因子受体和白细胞介素-1受体/Toll样受体超家族诱导信号的衔接因子，并在先天免疫反应中发挥关键作用［9］。动物试验发现TRAF6在ESCC细胞系中表达上调，并可调节细胞生长［10-11］。然而，TRAF6对ESCC病人复发和死亡影响的研究仍然有限。

本研究发现TRAF6阳性表达和ESCC病人的性别、年龄、肿瘤大小无关，但与ESCC病人的TNM分期、淋巴结转移、复发和死亡状况显著相关。TRAF6阳性表达阳性病人复发和死亡的风险增加。这与先前关于TRAF6对其他肿瘤病人预后影响的研究一致：TRAF6高表达与胃癌、舌癌、卵巢癌等肿瘤的不良预后相关［4-5，12］。表明TRAF6可能是ESCC复发和死亡的新型生物标志物。TRAF6可以同时调控核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）两条信号通路。通过调控食管癌组织中NF-κB、MAPK两条信号通路的异常激活，NF-κB转录活性的升高，可以增加食管癌化疗的耐药抵抗。MAPK家族主要包括细胞外信号调控激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、JNK/SAPK（c-Jun氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）3个信号通路。ERK和p38 MAPK均在食管癌组织中存在高表达，并影响食管癌病人的预后［13］。JNK/SAPK磷酸化后可促进食管癌组织中瘤体的生长和血管的形成，抑制JNK/SAPK的活性可抑制食管癌侵袭［14-15］。此外，抑制TRAF6的表达可显著抑制多种肿瘤细胞的增殖和侵袭，并促进细胞周期的凋亡［13，16-18］。提示TRAF6可能在肿瘤的发生发展中发挥重要的病理生理学作用。

综上所述，TRAF6在ESCC癌组织中的表达参与ESCC的发生发展，TRAF6表达阳性病人复发和死亡的风险增加，TRAF6可作为ESCC潜在的治疗靶点。

（本文图1，2见封3）

图1 食管鳞状细胞癌病人癌组织中肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）表达（免疫组织化学染色×200）：A为阳性；B为阴性

图2 肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）表达与食管鳞状细胞癌445例生存率的相关性：A为无瘤生存率；B为总体生存率