利用液液萃取降低莫西克汀杂质含量的研究

何勇崴，岳光

(北大医药重庆大新药业股份有限公司，重庆 400714)

莫西克汀(moxidectin)是一种新型的抗寄生虫药(图1)，是由链霉素进行发酵生产，纯化后再进行半合成得到的一种，成分单一的大环内酯类物质。CAS号为113507-06-5，分子量为639.83，其外观为白色或类白色无定形粉末，属于第三代阿维菌素类药物[1]。

对牛辐射食道口线虫(Oesophagostomum radiatum)和Trichurrisdiscolor(未命名)线虫等第三阶段幼虫的驱杀率达98%。在绵羊体内，耐伊维菌素(Ivermectin，IVM)的捻转血矛线虫对莫西克汀敏感[2]。莫西克汀对猪体内的消化道线虫、肺线虫和体外寄生虫都有良好的驱杀效果[3]。

莫西克汀和其它大环内酯类驱虫药的不同之处在于，它是单一成分，有着更高的驱虫活性和长效、安全等特性，且极低剂量下就有很强的抗线虫和节肢动物等体外寄生虫活性[4]，目前生产厂商有美国诺华公司和日本三共公司。

图1 莫西克汀

目前生产上对于莫西克汀纯化工艺，除了少数使用高压制备柱分离外，主要还是采用树脂或者硅胶为填料的常压/低压柱层析[5-6]。在进行色谱分离的时候对收率、纯度影响最大的三个杂质为A、E、F杂质(图2)。欧洲药典9.0版对其成品中的含量要求为，HPLC检测A杂质含量≤1.5%，E+F杂质含量≤1.7%[7]。但是我们在实验中意外的发现，在两种不相溶的溶剂同时存在的时候，溶剂中莫西克汀和那3个杂质之间的组分比例发生了很大的变化，可以尝试利用杂质和莫西克汀在溶剂中分配系数的不同来进行分离，降低这3个杂质在莫西克汀中的含量。

图2 莫西克汀A杂质、F杂质、E杂质结构式[7]

1 材料、仪器和方法

1.1 材料

1.1.1 样品

莫西克汀粗品由北大医药重庆大新药业股份有限公司提供，颜色为浅黄色无定型粉末，为了现象更明显，选择收集了采用柱色谱层析分离过程中A、E、F较高的部分混合制作的粗品。

1.1.2 化学试剂

HPLC用的甲醇和乙腈均为色谱纯，为国药集团“沃凯”牌；液/液平衡使用的溶剂甲醇、甲苯、二氯甲烷、庚烷均为分析纯，购置于国药集团化学试剂有限公司；莫西克汀标准品为北大医药大新药业股份有限公司提供。

1.1.3 主要实验设备

岛津高压液相TL-2010；上海沪析RWD5顶置搅拌机实验室电动搅拌机；500mL梨型玻璃分液漏斗；金坛DF101B集热式磁力搅拌器恒温水浴锅电动搅拌器。

1.2 莫西克汀的标准曲线绘制

准确称取莫西克汀标准品0.02516g(标准品ID号：177790，含量94.8%，产品编号：Y0000772)，置于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度线，配制成质量浓度为954μg/mL的莫西克汀标准母液，然后再依次稀释成质量浓度分别为0.48、1.91、9.54、14.31、19.08、28.62μg/mL的莫西克汀标准溶液，将莫西克汀标准溶液在以下色谱条件下进样检测。色谱柱：Waters Nova Pak C18 4μm，Φ3.9mm×150mm；流动相：称取乙酸铵约7.7g于400mL纯化水中，然后使用冰醋酸将溶液调节至pH4.8，然后加入600mL的乙腈，混匀，过滤并脱气，即得；流速：2.5mL/min；进样量10μL；检测波长：242nm；柱温：50℃。以莫西克汀标准溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3 不同组成的两相溶剂对莫西克汀和杂质组分的分离效果

1.3.1 不同溶剂之间的相互溶解性

考虑到生产经常使用的溶剂，所以考虑到经济性、毒性、安全性以及产品的溶剂残留问题，选择了甲苯、二氯甲烷、正庚烷为非极性相，分别和甲醇的不同浓度的水溶液组成的极性相溶剂，进行液液萃取。为了保证最大的分离效果，组成的两相应该有最小的互溶度。考虑到莫西克汀在甲醇溶液中的溶解度，所以考虑含有30%～50%甲醇的甲醇溶液。分别将甲苯等体积和50%甲醇溶液，40%甲醇溶液，30%甲醇溶液混合，同样方法进行二氯甲烷、正庚烷的实验，考察甲醇溶液和实验的非极性相的互溶情况。

1.3.2 在常温下非极性溶剂中莫西克汀的溶解度

根据上面实验选定的非极性溶剂，考察此溶剂在常温20～25℃下对莫西克汀的溶解性，取10mL选定溶剂于15mL的具塞磨口比色管内。缓慢向其中加入莫西克汀的固体粉末，密闭磨口塞情况下不断震动溶解，直到有少许溶解不完后停止加入粗品，计量加入的粗品总量。再多次少量添加溶剂溶解，直到粗品刚刚溶解完全，计量添加的溶剂量，通过这种方式计算得到一个大概的溶剂对莫西克汀的溶解度。

1.3.3 正交对比不互溶的两相溶剂中莫西克汀和杂质的分配效果

根据优选的非水溶性溶剂，进行30%、40%、50%甲醇溶液的平衡萃取实验。每种浓度的甲醇溶液和非水溶性溶剂进行四次平衡萃取。检测每次萃取后，甲醇溶液和非水溶性溶剂中的色谱纯度和莫西克汀的单位变化。

2 结果与分析

2.1 莫西克汀的标准曲线的绘制

以莫西克汀标准液的质量浓度为纵坐标，峰面积为横坐标绘制标准曲线，得到其回归方程:y=0.0001X+0.1450，线性相关系数为0.9999。该标准曲线显示莫西克汀在线性范围0.48～28.98μg/mL范围内具有良好的线性关系。根据此标准曲线能准确地得到莫西克汀的实际质量浓度(图4)。

2.2 不同组成的两相溶剂对莫西克汀和杂质组分的分离效果

2.2.1 不同溶剂之间的相互溶解性

实验结果表明和甲醇溶液互溶性最小的是庚烷，其次是二氯甲烷，互溶性最好的是甲苯。所以选择庚烷做为液液萃取相的非极性相。

2.2.2 在常温下溶剂中莫西克汀的溶解度

实验结果表明在20～25℃环境下，正庚烷对莫西克汀粗品的大致溶解度为8.3g/L。但是考虑到在大生产环境下能够保证粗品的完全溶解，将庚烷溶解莫西克汀粗品的量调整到7.5～7g/L比较合理。

2.2.3 对比不互溶的两相溶剂中莫西克汀和杂质的分配效果

如表1、2、3、4所示，通过四次萃取，使用等体积的30%、40%、50%甲醇溶液萃取粗品的庚烷溶解液后，A杂质的含量水平均降低到了1.5%以下，E+F杂质的含量水平均降低到了0.5%以下。杂质降低幅度最大的是50%甲醇水溶剂组，但是庚烷单次萃取收率和总萃取收率是最低的。综合收率因素，30%甲醇溶液萃取组是效果最好的。最佳的萃取次数是三次。

图4 莫西克汀标准曲线

表1 30%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量变化

表2 40%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量变化

表3 50%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量变化

表4 三种浓度甲醇溶液和庚烷液液萃取的收率

3 讨论

目前生产上用常压柱层析纯化的主要填料是苯乙烯-聚乙烯苯系大孔树脂或无定型硅胶。由于处理量的要求，树脂用量大、层析柱高，为了保证层析流速，层析填料只能采用大颗粒填料。例如代表性大孔树脂日本三菱的HP20，其平均粒径250μm；无定型硅胶一般为粒径180～220μm，这两者很难做到表1、2、3中液液萃取后庚烷相中A杂质、E+F杂含量水平。要到达同等水平，只能使用更细的填料，例如粒径50μm大小中压填料和粒径20μm大小制备柱填料来再次精制，这需要付出高昂的成本—这体现在昂贵的填料价格和设备价格，较低的上柱量，使用大量的有机溶媒和回收带来的高能耗、大量污水。

本实验结果让我们看到了另外一种使用较少成本代价达到降低杂质的目的方法。

本实验只对抗生素生产中常用的几种溶剂进行了初步筛选，确定了以30%甲醇溶液和庚烷进行液液萃取。该方法可能不是最优的结果，但是该方法过程操作简单，对生产设备要求不高，绝大部分生产线不用改造即可使用。使用溶媒毒性低，来源广泛，价格不高。综合这些因素考虑，此方法是一个比较好的选择。

实验中发现在30%、40%、50%甲醇溶液和溶解粗品的庚烷溶剂进行萃取的过程中都存在几个现象：

(1)随着萃取次数的增加，萃取甲醇溶液层中莫西克汀和杂质的含量，与被萃取的庚烷层中莫西克汀和杂质的含量，趋于一致，暗示对杂质没有了明显的选择性；(2)随着萃取次数的增加，萃取甲醇溶液中莫西克汀的含量在逐步增加，说明甲醇溶液对产品的溶解度加大，但是到最后趋于一致；(3)A杂质，E和F杂质最初在甲醇溶液萃取液中的含量较高，随着萃取次数的增加，含量急剧降低，最后趋于和莫西克汀的含量形成一个固定的比值。

这些现象暗示，在庚烷和甲醇溶液组成的两相液/液萃取体系中，除去莫西克汀及杂质组分参与了分配平衡外，可能还有紫外检测不到的物质参与了系统的分配平衡，是它改变了系统对莫西克汀和杂质的分配情况导致了萃取初期表现出了对A、E、F杂质的特异性选择。随着萃取次数的增多，其对系统分配平衡的影响在减弱，最终两相系统的萃取平衡趋于一致。因此这种未知物质可能为我们提供一个思路，即尝试找到起同样效果的一种溶剂或者混合溶剂，通过在液/液萃取平衡中添加这种溶剂来实现每次都是特异性萃取的效果，这样既降低了萃取中莫西克汀的损耗，也提高了杂质的去除效率。因此在后续工作中，我们会尝试去寻找和验证这种溶剂，继续提高莫西克汀的收率。