离子交换色谱法检测尿液草酸根、磷酸根和枸橼酸根的性能评价

尹晶平，郑东，张政，丰斌，祁松楠，唐琴晴，黄惠芳，邱骏(苏州大学附属第一医院临床检测中心，江苏苏州215006)

泌尿系统结石是泌尿外科常见的疾病之一，发病率及复发率高[1]，其中以磷酸钙、磷酸铵镁和草酸钙结石为主。尿液内磷酸盐、草酸盐等浓度增大时，晶体物质即可析出沉淀形成尿路结石；高浓度的枸橼酸及其盐对泌尿系统结石的形成具有重要的抑制作用。因此，检测尿液中草酸根、磷酸根及枸橼酸根浓度，对研究及诊断泌尿系结石非常重要。目前，临床上常用高效液相色谱法[2-3]、比色法[4-5]等对尿液中的草酸根、磷酸根、枸橼酸根进行测定，但高效液相色谱法使用的流动相复杂，对尿液中少量的蛋白质需利用沉淀法去除且耗时较长；而比色法一般灵敏度较低、特异性和重复性较差。基于现有检测草酸根、磷酸根、枸橼酸根的方法存在诸多不足，本研究建立一种离子交换色谱法对尿液中草酸根、磷酸根及枸橼酸根进行测定，并对其进行性能评估，以期为尿路结石病的预防与治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要仪器与试剂 CIC-D120型离子色谱仪及SH-AC-11阴性色谱柱(柱尺寸：4. 6 mm×250 mm),SH IC-C18前处理小柱(规格：QTY50/2 mL，青岛盛瀚公司)。浓盐酸—样品(CAS号：7647-01-0)购自无锡展望化工试剂公司；枸橼酸标准品—标准样品[批号：DL9Q-X3SX规格：30 mg(0.16 mmol)]、磷酸根标准溶液—标准样品[批号：GBW(E)083180；规格：1 000 mg/L(10.53 mmol/L)]、草酸根标准溶液—标准样品[批号：GBW(E)081605；规格：0.05 mol/L]均购自中国食品药品研究院。

1.2方法 本研究中色谱系统使用梯度浓度的氢氧化钾为流动相，流速为1 mL/min。性能验证方法及标准均参照《中国药典》(2015年版)通则中9012“生物样品定量分析方法验证指导原则”[6]。

1.2.1检出限 分别选取草酸根(5 mg/L)、磷酸根(10 mg/L)、枸橼酸根(10 mg/L)样本离子浓度进行测定，进样体积25 μL，记录色谱图，计算最小检测浓度Cmin，公式Cmin=(2HN×C×V)/25H，其中Cmin：最小检测浓度，μg/mL；HN：基线噪音峰峰值，μS；C：标准溶液浓度，μg/mL；H：标准溶液的色谱峰高，μS；V：进样体积，μL。

1.2.2定量下限 将标准品梯度稀释配制成0.2、0.5、1.0 mg/L 3个浓度样本，每份样本重复检测5次，计算其变异系数(CV)及偏差(bias)，将同时满足偏差≤15%、CV≤20%的最低浓度值作为定量下限。

1.2.3携带污染率(残留) 先检测高浓度样本，校正为标样(100 mg/L)后，再检测空白样品计算残留。首先计算出空白样品和高浓度样本的实测值，再计算空白样品的实测值(A1表示)和定量下限样本的实测值(A2表示)。携带污染率=(A1-A2)/A2×100%，以高浓度样品之后在空白样品中的携带污染率(残留)不超过定量下限的20%为评价标准。

1.2.4线性评价 将100 mg/L标准品用蒸馏水稀释为7个浓度(草酸根为50、25、10、5、2.5、1、0.5 mg/L；磷酸根和枸橼酸根为100、50、20、10、5、2、1 mg/L)，分别重复检测3次，取均值。以各浓度的检测偏差百分比<15%，且曲线的回归系数(R2)>0.995判为呈线性。

1.2.5样本保存剂(盐酸)验证 分别向1.93 mg/mL草酸根溶液加入1.0 mg/mL标液，磷酸根溶液(浓度分别为79.8、15.76、24.54 mg/L)加入20.0 mg/mL标液，枸橼酸根溶液(11.72、14.72、6.72 mg/L)加入10.0 mg/mL标液。分别加入6 mmol/L盐酸30 mL、60 mmol/L盐酸30 mL、60 mol/L盐酸100 mL及浓盐酸调pH<1等4个不同浓度的盐酸保存样本后，测定各样本浓度，计算各组分的偏差，以偏差±20%之内为评价合格标准。

1.2.6精密度 分别对尿液中草酸根(1.41 mg/mL)、磷酸根(19.46 mg/mL)和枸橼酸根(14.28 mg/mL)的3个加标(草酸加标浓度值分别为1、10、25 mg/L；磷酸和枸橼酸加标浓度值分别为2、20、50 mg/L)后样本进行连续检测，每个浓度平行5份样本，连续检测3个批次，共计45份样本。使用Excel 2010软件计算检测方法的精密度(以CV表示)。计算公式：CV批内=SD批内/批内均值×100%，CV批间=SD批间/总均值×100%。

1.2.7回收率评价 分别对尿液中草酸根(1.41 mg/mL)、磷酸根(19.46 mg/mL)和枸橼酸根(14.28 mg/mL)的3个加标(草酸加标浓度值分别为1、10、25 mg/L，磷酸根和枸橼酸根加标浓度值分别为2、20、50 mg/L)后样本进行连续检测，每个浓度平行5份样本，连续检测3个批次，共计45份样本。扣除基质本底浓度后，计算各组分的加标回收率，加标回收率要求在80%～120%。

1.2.8样本稳定性 样本加入保存剂后，置于4 ℃保存，分别在第1、2、3和4天共4个时间点进样分析，记录每个时间点的检测结果，平行进行3组实验。不同时间点各组分含量相对于初始检测点含量的相对偏差应≤5%，表明样本稳定；如果相对偏差超过15%，表明样品已发生变化且影响最终定量结果。

2 结果

2.1检出限和定量下限 检测标准草酸根溶液(5 mg/L)、标准磷酸根溶液(10 mg/L)、标准枸橼酸根溶液(10 mg/L)的基线噪音均为92 μV；峰高分别为82 790 μV、80 086 μV、94 655 μV；检出限分别为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.02 mg/L。草酸根在0.5 mg/L时偏差为7.78%、CV为3.84%，磷酸根在1.0 mg/L时偏差为-3.17%、CV为8.15%；枸橼酸根在1.0 mg/L时偏差为-7.50%、CV为4.94%；偏差及CV均满足标准。故而草酸根定量下限为0.5 mg/L，磷酸根的定量下限为1.0 mg/L，枸橼酸根的定量下限为1.0 mg/L(表1)。

表1 定量下限检测结果

2.2携带污染率(残留) 进样检测尿液样本时草酸根、磷酸根和枸橼酸根分别在13.857 min、23.278 min和30.378 min处出峰(图1A)，在进样100 mg/L浓度标准品后再接纯水进样，由图1B中可以明显看出在13.857 min、23.278 min和30.378 min处基线平稳，没有出峰迹象，携带污染率符合要求，表明检测方法不存在明显的携带污染。

注：A，浓度100 mg/L草酸根离子、磷酸根离子和枸橼酸根离子；B，纯水。

2.3线性评价 检测7个不同浓度样本结果显示，草酸根、磷酸根、枸橼酸根分别在0.5～50 mg/L、1～100 mg/L、1～100 mg/L范围内的相关系数(R2)均大于0.995(表2)；各浓度点的偏差<15%(表3)。表明离子交换色谱法检测草酸根、磷酸根、枸橼酸根具有良好的线性关系。

表2 离子交换色谱法检测3种离子的线性范围

2.4样本保存剂(盐酸)验证 加入4个不同浓度盐酸保存样本后检测草酸根、磷酸根、枸橼酸根浓度，结果表明在加入6 mmol/L盐酸30 mL时，草酸根、磷酸根和枸橼酸根偏差最小且均能达到要求，表明该浓度样本保存剂符合临床检测要求(表4)。

表3 离子交换色谱法检测草酸根的线性评价

表4 不同浓度样本保存剂检测结果

2.5精密度验证结果 采用离子交换色谱法检测草酸根、磷酸根和枸橼酸根3个不同浓度的批内CV和批间CV均在5%之内(表5)，表明该方法具有良好的精密度。

表5 草酸根、磷酸根、枸橼酸根精密度实验结果

2.6回收率评价结果 分别对草酸根、磷酸根和枸橼酸根3个浓度(草酸根加标浓度值为1、10、25 mg/L，磷酸根和枸橼酸根加标浓度2、20、50 mg/L)的准确性进行验证。验证结果证实，草酸根在3个浓度的加标回收率为92.00%～101.56%，磷酸根在3个浓度的加标回收率为100.10%～101.80%，枸橼酸根在3个浓度的加标回收率为97.16%～100.80%，表明该方法具有良好的准确性。见表6。

表6 回收实验结果(mg/L)

2.7样本稳定性 通过保存不同时间的检测结果发现，4个浓度样本在第1、2、3和4天相对0 d的相对偏差均≤15%(表7)。表明尿液中草酸根、磷酸根和枸橼酸根在保存条件下保存4 d结果稳定。

表7 草酸根、磷酸根和枸橼酸根样本稳定性实验结果

3 讨论

研究表明，枸橼酸根能通过有效减少尿液中钙离子浓度，发挥其抑制草酸钙结石形成的作用；泌尿系统结石患者低枸橼酸尿症的占比高达40.5%～63%[7]。一项对尿结石成分分析研究表明，尿结石患者中90.5%存在代谢异常，其中约64.5%为高草酸尿症，其次是高钙尿症、低枸橼酸尿症等[8]。高草酸尿症易发草酸钙结石或草酸钙/磷酸钙等混合成分结石；同时低枸橼酸尿症易发草酸钙、磷酸钙结石。因此，检测尿液中草酸根、磷酸根、枸橼酸根的离子浓度对尿路结石的预防、诊疗具有重要作用。

目前，临床上对于草酸根、磷酸根、枸橼酸根等离子的检测尚无便捷的方法。离子交换色谱法是利用被分离组分离子交换能力的差异或选择性系数的差异而实现分离的方法。按照可交换离子所带电荷符号的不同又可分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。本研究选用阴离子交换色谱柱，其优点是临床上在留取尿液样本时加入盐酸酸化，可防止草酸浓度的变化，同时通过0.2 μm的微孔滤膜过滤和前处理小柱可以有效去除有机物和重金属，以保护色谱柱。

本研究建立了离子色谱交换法检测尿液中草酸根、磷酸根和枸橼酸根的方法并进行了系统的评价。结果表明，尿液中草酸根、磷酸根和枸橼酸根携带污染率<5%，无明显携带污染现象，因此不同浓度的样品间不存在交叉污染，特别是高浓度样本对后续的低浓度样品检测无影响。离子交换色谱法检测草酸根、磷酸根和枸橼酸根线性相关系数R2均大于0.999，表明该方法具有良好的线性和较高的灵敏度，检出限及定量下限均能满足临床需求。同时，该检测方法的CV<5%，回收率为80%～120%，表明该检测方法具有良好的准确性和重复性。尿液标本4 ℃静置4 d以内相对于0 d的相对偏差均在±15%内，可认为尿液中草酸根、磷酸根离子和枸橼酸根离子在4 ℃保存4 d是稳定的，符合临床检测要求。本研究中不足的之处是没有比较本方法定量检测的草酸根、磷酸根与定量尿沉渣、人工镜检草酸根结晶、磷酸根结晶的相关性，有待于进一步研究证实。