太平洋牡蛎胞外超氧化物歧化酶同源基因与蛋白质分析

毛小伟, 薛清刚, 夏淇峰, 李登峰, 林志华

(1. 宁波大学 海洋学院， 宁波 315010； 2. 青岛海洋科学技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室， 青岛 266071； 3. 浙江万里学院 浙江省水产种质资源重点实验室， 宁波 315100)

生长在海洋沿岸的贝类不断受到各种理化和生物性环境因素的影响，其中，剧烈波动的温度、盐度、pH值、溶解氧、病原生物和各种污染物均能对贝类构成胁迫。处于胁迫状态下的贝类，不仅生长发育滞缓，而且由于免疫力下降，容易受致病性或条件致病性微生物感染发病，而出现大规模死亡[1-4]。生物在胁迫条件下体内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成增加，蓄积的ROS能引起生物膜的氧化损伤，甚至造成细胞脂类、蛋白或 DNA 的严重破坏[5]。因此，包括金属污染等在内的多种环境因素可通过诱发氧化胁迫(oxidative stress)，从而对生物体造成损害[6]。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一些广泛存在于生物体内的抗氧化酶。根据所结合的金属离子不同而分为 3 类——铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)，锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶 (Fe-SOD)，其中，Cu/Zn-SOD依据在生物体内的存在部位又分成胞内(icCu/ZnSOD)和胞外(EC-SOD)两种亚型[7]。研究发现，Cu/Zn-SOD对于贝类免疫具有重要作用[8]，其作用机理一般认为与参与抗氧化防御(antioxidant defense)有关。

Gonzalez 等[9]报道了太平洋牡蛎(Crassostreagigas)血浆内的一种EC-SOD蛋白——Cg-EcSOD，认为其具有结合脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)和 SOD 酶活性。随后的研究中Cg-EcSOD被命名为cavortin[10-11]，但纯化后没有检测到SOD活性[11]。Cg-EcSOD在美洲牡蛎(Crassostreavirginica)中的直系同源蛋白——dominin纯化后也未检出SOD活性[12]。这说明牡蛎中存在的EC-SOD并不具备SOD活性，不是真正意义上的SOD。Ec-SOD蛋白是牡蛎血浆内含量比例最高的蛋白，SDS-PAGE分析显示其dominin占美洲牡蛎血浆总蛋白的近50%[12]。显然，牡蛎EC-SOD对于该物种有重要功能意义。既然该蛋白不能通过SOD活性发挥作用，那么其功能是什么呢？有研究显示，纯化的dominin含有多种金属[12]。而如果牡蛎EC-SOD通过分子进化而演变成一种金属结合蛋白，那么它就有可能在金属储运、解毒以及间接抗氧化过程中发挥作用。因此，本研究试图通过分析探讨太平洋牡蛎的EC-SOD蛋白参与金属代谢的可能性，为认识该蛋白的确切生物学功能提供依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

本研究所用太平洋牡蛎壳长8～12 cm，于2017年3月和11月采自山东省桑沟湾。2017年3月采集的牡蛎用于cDNA克隆，2017年11月采集的牡蛎用于金属刺激实验。牡蛎使用前置盐度23 psu、温度13 ℃过滤天然海水中暂养。血淋巴液使用配有25号针头的注射器经牡蛎背侧缘切口刺入闭壳肌抽取。抽取的血淋巴液800 g，4 ℃离心15 min，取血淋巴细胞立即液氮冷冻，并在-80 ℃下储存，直至提取RNA。上清液3000 g，4 ℃离心15 min，然后收集上清液作为血浆，-20 ℃保存。取血淋巴后，从每只牡蛎中取约50 mg的鳃组织，液氮快速冷冻，-80 ℃下保存直至提取RNA。

1.2 序列查找与分析

以美洲牡蛎dominin氨基酸序列(BAF30874)为查询序列，利用tblastx程序在太平洋牡蛎(Crassosteragigas)基因组库(Oyster_v9 Release 101)查找同源序列。将覆盖查询序列50%以上，E值小于1e-5，有单独标注基因号的氨基酸序列下载，用clustalw2软件[13-14]与查询序列、人胞质SOD(p00441)和人胞外SOD(p08294)做多重比对。通过搜索NCBI的保守域数据库(CDD)识别保守域[15-16]。根据序列数据库中所预测的内含子和外显子位置，确定基因编码区的结构。

1.3 序列验证

以总RNA抽提试剂盒(OMEGA)从太平洋牡蛎鳃组织和血淋巴细胞中提取总RNA，1%琼脂糖电泳检测其完整性，NanoVue 微量紫外分光光度计检测浓度和纯度。使用反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA。根据BLAST检索到的mRNAs的序列设计引物，PCR扩增全长cDNA(表1)。PCR 产物经电泳检测，胶回收试剂盒(TinGen) 割胶纯化。纯化后的产物与T1(TransGen)载体连接，转化到大肠杆菌 DHα(TaKaRa)中进行克隆，挑取阳性克隆测序。

表1 Cg-dominin克隆、重组表达以及荧光定量分析所用引物

1.4 Cg-dominin2重组蛋白的制备和抗氧化活性测定

设计特异性引物(表1)，使用PromegaTaq酶扩增Cg-dominin2成熟肽的cDNA片段，正向引物Cg-FM带有BamH I限制性酶切位点，反向引物Cg-RM带有XhoI酶切位点。将纯化后PCR产物克隆到pEASY-T1载体(TransGen)中，提取质粒并用限制性酶BamH I和XhoI消化，克隆到同样用BamH I和XhoI消化的表达载体pET-28a。将重组质粒pET-28a-Cg-dominin2转化到表达感受态BL21中(DE3)。筛选阳性克隆，使用引物Cg-FM和Cg-RM扩增测序进一步验证，选择无插入片段的pET-28a载体作为阴性对照。阳性克隆和阴性对照加入到LB培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中，37 ℃，以200 r/min，振荡培养。在培养液OD600达到0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度0.8 mmol/L进行诱导培养12 h。采用镍柱层析法纯化重组蛋白Cg-dominin2，在分别含有6、4、3、2、1和0 mol/L尿素的缓冲液(50 mmol/L 三氨基甲烷、50 mmol/L氯化钠、10%甘油、2 mmol/L还原谷胱甘肽和0.2 mmol/L氧化谷胱甘肽，pH 8.0)中，4 ℃，12 h，透析复性。复性纯化的蛋白质以10% 凝胶SDS-PAGE电泳分析，BCA法测定纯化后的rCg-Dominin2浓度[17]，并质谱测序鉴定。纯化的重组蛋白质活性分析前保存于-80 ℃。rCg-dominin2总抗氧化能力利用总抗氧化测定试剂盒(南京建成)测定。

1.5 金属刺激实验

金属刺激实验通过在23 盐度海水中加入氯化锌和氯化镉进行。实验中参照相应金属离子对褶牡蛎的半致死浓度[18]，分别选择2个浓度ZnCl2(60和100 mg/L)和2个浓度的CdCl2(6和10 mg/L)。取350只牡蛎，随机分为4个实验组，每组75只和1个50只的对照组。处理后0、3、6、12、24、48和72 h后，分别从每个实验组随机取10只牡蛎，从对照组取5只牡蛎，如前述过程分别取样血淋巴液和鳃组织。

1.6 Cg-dominin2基因表达实时荧光定量 PCR 检测

按照总RNA抽提试剂盒(OMEGA)方法提取 Zn2+和 Cd2+胁迫下太平洋牡蛎血淋巴细胞和鳃(n=3)的总RNA，由于3个Cg-dominin的mRNA序列高度相似，使得在PCR分析中通过设计引物来区分难以实现，在本研究中仅测定了Cg-dominin2。根据Cg-dominin2测序结果设计荧光定量 PCR 引物，采用qRT-PCR法，以太平洋牡蛎β-actin为内参。反应的总体积为20 μL，包含SYBR Green Mix (Bio-rad)10 μL，1∶100稀释的cDNA 2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL和ddH2O 6 μL。用ABI7500fast荧光定量PCR仪两步法进行扩增，即95 ℃预变性1 min； 95 ℃变性10 s，59.6 ℃延伸45 s，共40个循环。扩增结束后，从55 ℃缓慢升温到95 ℃，制备熔解曲线。每次反应都设置阴性对照和无模板对照，每个反应3个重复孔。Cg-dominin2的相对表达量用最小二乘法2-ΔΔCt法计算[19]，并利用 SPSS 13.0 软件进行双因素方差分析和Tukey检验。

1.7 血浆沉淀蛋白中金属含量的测定

采用PEG沉淀法制备了牡蛎主要血浆沉淀蛋白质。为了选择合适的PEG浓度，将牡蛎血浆在4 ℃下分别与7.5%、10%、12.5%、15%和17.5%的PEG6000水溶液1∶1混合15 min后4 ℃离心20 min，然后BCA测定法测定上清液蛋白质浓度，并以此建立不同PEG6000浓度沉淀后，上清液中剩余浓度曲线。最后基于建立的曲线，选择导致上清液中残留蛋白浓度达最低值的最小PEG浓度制备用于金属含量测定的沉淀血浆蛋白。以最终选择的PEG6000溶液按上述过程处理牡蛎血浆样品。离心后，去上清液，将沉淀的蛋白质以去离子水溶解并测定蛋白浓度。最后采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)测定样品锌和镉的含量(西安204军工研究所)。测定结果以单因素方差分析(ANOVA)和Tukey检验做统计学分析。

2 结果与分析

2.1 Cg-dominin基因、转录物和氨基酸序列分析

利用美洲牡蛎dominin序列，在太平洋牡蛎基因组数据库(Oyster_v9参考注释101版)检索，在不同的基因片段发现有5个潜在的dominin同源基因，其中3个在负链上，2个在正链上(表2)。其中3个外显子个数和大小高度一致的基因所编码的氨基酸序列，彼此之间序列一致性为92.2%～94.8%，与美洲牡蛎dominin的序列长度一致而且计算序列一致性达87.5%～88.5%，因此分别被命名为Cg-dominin1、Cg-dominin2和Cg-dominin3。其余的2个潜在基因(Cg-Cu/ZnSOD?1和Cg-Cu/ZnSOD?2)在外显子数目和大小、编码的氨基酸序列总长度上彼此之间及与前述3个序列之间差别明显，与美洲牡蛎dominin的序列一致性为52.6%～61.9%(图1)。多序列比对分析显示，Cg-dominin1、Cg-dominin2和Cg-dominin3均有一个18个氨基酸的信号肽，而Cg-Cu/ZnSOD?1和Cg-Cu/ZnSOD?2没有。同时，与dominin、人胞质SOD和人胞外SOD的氨基酸序列比对显示，5个太平洋牡蛎基因组内鉴定到的潜在基因和美洲牡蛎的dominin一样，均缺少SOD酶活性中心内7个结合Cu和Zn离子的氨基酸残基(图2)。因此，Cg-dominin1、Cg-dominin2和Cg-dominin3被确定为太平洋牡蛎dominin直系同源的Ec-SOD编码基因。PCR扩增测序获得了与3个基因相对应的mRNA序列长度分别为775 bp、679 bp和724 bp，3者均预测出含有一个576 bp开放阅读框，编码192个氨基酸，与基因组序列基础上预测的相应mRNA序列一致。

表2 太平洋牡蛎基因组中dominin的同源蛋白基因

方块、线条、数字分别代表外显子、内含子以及它们的序列长度(bp)；对于每一个基因，左边标注了基因名称以及在本文中的命名，右边标注其所在的基因组名称

图1以美洲牡蛎dominin为检索序列，在太平洋牡蛎基因组序列中识别得到的基因结构示意图

Figure 1 Schematic diagram of the genes identified from the Pacific oyster genome sequence usingCrassostreavirginicadominin as query

阴影部分为人体CuZnSODs对应酶活中心的序列中结合Cu和Zn的7个氨基酸残基

图2太平洋牡蛎基因组中潜在的dominin同源序列与查询序列、人胞质SOD(p00441)和人胞外SOD(p08294)的多重比对

Figure 2 Alignment of amino acid sequences of potential dominin homologues identified inCrassostreagigasgenome with query and 2 human CuZnSODs, cytoplasmic SOD (HuCySOD, P00441) and extracellular SOD (HuEcSOD, P08294)

2.2 Cg-dominin2基因体外重组表达和活性测定

构建的重组表达质粒转化到BL21表达感受态细胞，经IPTG诱导后，通过10% SDS-PAGE分析全细胞裂解产物，考马斯亮蓝染色，发现一条分子量35 ku的明显条带，通过质谱测序验证确定为Cg-dominin2重组蛋白，经镍柱亲和层析法纯化得到目的蛋白(图3)。纯化的Cg-dominin2重组蛋白的总抗氧化活性为每克蛋白质相当于0.0525 mmol/L Trolox。

M：蛋白质分子量标准； 1：未经 IPTG 诱导的菌株； 2：IPTG 诱导的菌株； 3：pET-28a空载体； 4：纯化后的Cg-dominin2重组蛋白

图3SDS-PAGE检测Cg-dominin2重组蛋白

Figure 3 Detection of Cg-dominin2 recombinant protein by SDS-PAGE

2.3 锌和镉胁迫下的Cg-dominin2基因表达

60和100 mg/L ZnCl2刺激后，太平洋牡蛎血淋巴细胞和鳃中Cg-dominin2基因表达均显示为先升后降(图4-A、B)。血淋巴细胞中2个刺激浓度对应的表达高峰分别出现在刺激后48 h和12 h，相应表达水平分别为对照组的4.8倍和3.7倍，差别有高度显著性(P<0.01)。而鳃中的对应表达高峰分别出现在刺激后24 h和12 h，其中，60 mg/L的ZnCl2刺激下的最高表达水平是对照组的2.1倍，差别有显著性(P<0.05)。

A和B分别为在ZnCl2胁迫下，Cg-dominin2基因在血淋巴细胞(A)和鳃(B)中的相对表达量; C和D分别为在CdCl2胁迫下，Cg-dominin2基因在血淋巴细胞(C)和鳃(D)中的相对表达量。“*”表示差异显著，“**”表示差异极显著。下同

图4在ZnCl2和CdCl2胁迫下，太平洋牡蛎血淋巴细胞和鳃中Cg-dominin2基因表达分析
Figure 4 The expression levels ofCg-dominin2 in hemocytes and gills ofCrassostreagigasfollowing challenges by ZnCl2and CdCl2

6和10 mg/L CdCl2刺激后，太平洋牡蛎血淋巴细胞和鳃中Cg-dominin2基因表达也显示先升后降的趋势(图4-C、D)。血淋巴细胞中2个刺激浓度对应的表达高峰分别出现在刺激后12 h和48 h，相应表达水平分别为对照组的4.4倍和2.2倍，差别均有高度显著性(P<0.01)。而鳃中的对应表达高峰分别出现在刺激后24 h和48 h，相应表达水平为对照组的2.7倍和4.2倍，差别均有高度显著性(P<0.01)。

2.4 金属刺激后太平洋牡蛎血浆沉淀蛋白质中相应金属含量

ZnCl2刺激后，太平洋牡蛎血浆沉淀蛋白质中的Zn含量相对于对照组含量均显著升高(P<0.01)，但2个刺激浓度之间及不同取样时间点之间的含量水平未发现显著差异(图5-A)。

CdCl2刺激后血浆沉淀蛋白中Cd含量在2个刺激浓度间显示出差别(图5-B)。6 mg/L CdCl2刺激下，沉淀蛋白中Cd含量水平在刺激后72 h开始升高，并与对照组有显著性差别(P<0.05)。而在10 mg/L CdCl2刺激下，血浆沉淀蛋白中的Cd含量显著升高，并与对照组和6 mg/L刺激组有高度显著性差别(P<0.01)，但3个取样时间点之间未发现显著性差别。

A为ZnCl2胁迫下太平洋牡蛎血浆沉淀蛋白质中锌含量; B为CdCl2胁迫下太平洋牡蛎血浆沉淀蛋白质中镉含量

图5在ZnCl2和CdCl2胁迫下太平洋牡蛎血浆沉淀蛋白质中对应金属含量
Figure 5 Zinc and cadmium contents in the plasma protein inCrassostreagigaschallenged respectively by ZnCl2and CdCl2

3 讨论

美洲牡蛎的dominin与文献报道的太平洋牡蛎Cg-EcSOD/cavortin属序列相似度极高的直系同源蛋白，属Ec-SOD家族蛋白[12]。通过全基因组序列分析，在太平洋牡蛎基因组内鉴定出5个与dominin序列相似性有显著意义的基因。其中3个与dominin序列长度一致且氨基酸序列一致性超过80%，说明它们与dominin有显著同源性，均是太平洋牡蛎Ec-SOD蛋白的编码基因。而另外两个序列与dominin显著不同，不仅长度短，而且没有信号肽。迄今为止绝大多数动物基因组中只有1～2个Ec-SOD基因，有些物种甚至没有。而太平洋牡蛎有彼此序列相似度超过90%的3个基因。这一方面可以解释为什么dominin相关蛋白质构成血浆总蛋白的近50%[12]，另一方面提示这些蛋白质对于牡蛎物种生存有重要意义。

多项研究已经证明dominin相关蛋白没有SOD酶活性。Scotti等报道，太平洋牡蛎血浆中的cavortin尽管含有SOD结构域，但是不具备SOD活性[11]。同样，美洲牡蛎的dominin也有SOD结构域，但没有SOD活性[12]。具备类似特征的蛋白质还包括悉尼石牡蛎中的SgEcSOD[20]和新西兰绿唇蚌中的Pernin[21]。而这些蛋白质共有的一个结构特征是对应酶活性中心的结构域内缺少结合催化离子Cu2+和稳定局部结构的Zn2+。这与本研究所发现的3个太平洋牡蛎同源分子一致。那么，这些蛋白质是否有基于其他作用原理的抗氧化活性呢？我们测得太平洋牡蛎重组Cg-dominin2蛋白总抗氧化活性为每克重组蛋白相当于0.0525 mmol/L Trolox，抗氧化能力显然太弱，似乎不可能通过直接抗氧化活性在抵御环境胁迫中发挥作用。

锌是生物体中最重要的微量元素之一，对微生物、植物和动物的生长发育至关重要。然而，高浓度锌有潜在细胞毒性，大多数细胞必须将锌含量保持在稳定的水平[22]。而镉是常见的污染重金属，对于双壳贝类，镉离子能够钙通道穿过细胞膜，干扰细胞内各种代谢过程、膜转运、蛋白质合成和DNA修复机制等[23-26]。有研究表明，CuZn-SOD是细胞针对锌离子胁迫做出反应的主要蛋白质之一，推测其金属结合能力与消除锌的毒性作用有关[27]。为了揭示太平洋牡蛎Cg-dominin基因参与太平洋牡蛎金属代谢的作用机制，本文检测了血淋巴细胞和鳃中Cg-dominin2基因在受到Cd和Zn金属刺激后的表达量，结果发现，两种组织中Cg-dominin2基因的表达量均有显著性上升，然后逐渐下降，显然Cg-dominin2基因参与了太平洋牡蛎对Cd和Zn的解毒作用。而且这种表达水平变化与金属浓度相关，变化模式与涉及的金属离子也有关。对于Zn，高浓度比低浓度更快地刺激Cg-dominin2基因表达；而对于Cd，低浓度诱导作用更显著。后者可能与过高浓度的Cd离子抑制细胞总体活性有关。除基因表达增加外，Zn和Cd刺激后的牡蛎血浆蛋白内相应金属含量也增加。纯化的cavortin和dominin均发现携带多种金属离子[11-12]。本研究中PEG沉淀的牡蛎血浆蛋白也出现了大小相对均匀的蛋白颗粒(结果另外报道)，那么可以推测，本研究所观察的Zn和Cd离子刺激后牡蛎血浆蛋白中增加的相应金属至少部分结合到了Ec-SOD相关蛋白质上，参与了金属转运和解毒。而这种金属解毒功能有可能起到间接抗氧化作用。当然，这些推测有待于今后进一步实验验证。