电项针干预对脑出血大鼠急性期脑组织中血红素加氧酶-1表达及神经损伤的影响∗

柳依江 沈诗彦 杜若桑 张晓辉 邵文娜 崔 海△

（1.首都医科大学，北京 100069；2.浙江省杭州市杭州种福堂中医医院，浙江 杭州 310011）

脑出血是一种严重的，有着高死亡率和不良预后的卒中类型[1-4]。在我国，相比30年前的同类调查，脑出血流行状况十分严峻，其患病率、发病率大幅上升，为患者及社会带来沉重负担[5]，其病理过程主要为血液在脑实质中快速蓄积，导致颅内压增高、脑组织损伤[6]。脑出血致死的患者中，近半数出现在出血后2 d内[7]，其中，血肿源性毒性产物、氧化应激反应和促炎性反应在继发性损伤过程中起到重要作用[8-11]。

血红素加氧酶-1（HO-1）及其代谢产物的活性能对氧化损伤、细胞凋亡、细胞增殖等生物过程起关键作用[12-13]。已有研究表明，药物激活HO-1活性能够调节氧化应激反应，抑制水肿进展，减轻早期脑损伤，给予抑制剂组则损伤加重[14]。本实验以HO-1表达为关注点，通过观察脑出血急性期脑组织中含量变化，探讨电项针干预对脑出血大鼠继发性损伤的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只SPF级雄性SD大鼠购自首都医科大学实验动物部，体质量（300±20）g。分笼饲养于首都医科大学动物房屏障环境，光照周期为12 h模拟昼夜交替，温度为（23±2）℃，自由饮水，SPF级饲料喂养，合格证号：SCXK（京）2016-0011。

1.2 试药与仪器

锌原卟啉-9（ZPP-Ⅸ）（美国 Frontier Scientific），qPCR试剂盒（美国KAPA Biosystems），逆转录试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）。桌面数显脑立体定位仪（深圳RWD Life Science），华佗牌电子针疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），分析天平（德国Sartorius），高速冷冻离心机（Beckman公司），实时定量PCR仪（美国ABI），分光光度计（上海菁华科技有限公司），电热鼓风干燥箱（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.3 分组与造模

实验动物随机分成5组，假手术组、模型组、电项针组、ZPP-Ⅸ模型组、ZPP-Ⅸ电项针组。实验采用自体血注入尾状核形成血肿，制备自体血脑出血模型[15]。操作步骤：使用20%乌拉坦（7 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定于脑立体定位仪上，头部备皮，常规消毒后沿正中线切开约1 cm，确定前囟位置，根据大鼠脑定位图谱确定右侧尾状核位置（前囟右3 mm，后0.2 mm）[16]，使用牙科钻打孔（d=1 mm），深度至硬脑膜且不伤及脑实质。用1 mL注射器尾静脉抽取约100 μL，转移到100 μL微量注射器后固定在定位仪上。微量注射器垂直方向缓慢进针，深度为5.5 mm，以5 μL/min速度匀速泵入50 μL血液，注射后留针10 min，缓慢退针。骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤并消毒。ZPP-Ⅸ模型组、ZPP-Ⅸ电项针组在造模后30 min腹腔注射ZPP-Ⅸ（质量浓度10 mg/mL，剂量10 mg/kg）。假手术组除不注入自体血外，其余操作同模型组。造模1 d后，使用Longa评分[17]对大鼠神经功能进行评价，评分大于1分可认为造模成功，则纳入实验，否则剔除。数量不足则根据随机分配补齐并造模。

1.4 干预方法

根据《实验针灸学》选择供血（颈4夹脊穴）、风池给予电项针干预[18]。常规消毒后使用毫针进针3 mm，华佗电子针疗仪正极接风池，负极接供血。选择疏波，频率1 Hz，留针30 min。电项针组和ZPP-Ⅸ电项针组造模后连续3 d给予干预，其他组不干预。

1.5 检测指标

1.5.1 脑组织HO-1 mRNA测定 造模后第3天给予麻醉并断头取脑，保存于-80℃。选择血肿周围组织，取100 mg使用试剂盒提取样本总RNA。检索HO-1核苷酸序列设计引物。引物合成反转录成cDNA并进行扩增，进行 Real-time PCR 检测，采用 2（-ΔΔCt）值进行数据统计。引物序列信息见表1。

表1 目的基因引物序列

1.5.2 神经功能缺损程度评分 使用Longa评分[17]对大鼠神经功能进行评价。0分：未见任何神经损伤症状。1分：病灶对侧前肢或后肢不能伸直。2分：行走时偏向患侧偏转。3分：行走过程向患侧倾倒不能站立。4分：不能行走且有意识障碍。

1.5.3 脑组织含水量测定 在相应时间点取材，将用于测量含水量的脑组织用分析天平秤质量，得到湿质量；置于烘箱内用60℃烘干48 h以上，多次称量至质量不再减少，得到干质量。脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.6 统计学处理

应用GraphPad Prism7进行统计。计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时采用LSD分析，方差不齐时采用Dunnettt检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织HO-1 mRNA含量比较

见表2。相较于假手术组，其他各组HO-1 mRNA表达均显著增加，并且电项针组HO-1表达高于模型组（P＜0.01）。给予抑制剂后，ZPP-Ⅸ模型组、ZPP-Ⅸ电项针组较假手术组HO-1均有增高，但组间差异不具有统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠脑组织HO-1 mRNA的表达比较（2-ΔΔCt，±s）

表2 各组大鼠脑组织HO-1 mRNA的表达比较（2-ΔΔCt，±s）

与假手术组比较，∗P ＜0.05，∗∗P ＜ 0.01；与模型组比较，△P＜ 0.05，△△P＜0.01。下同

组别HO-1 mRNA n假手术组模型组电项针组ZPP-Ⅸ模型组ZPP-Ⅸ电项针组0.578±0.099 1.618±0.328**2.805±0.357**△△1.103±0.220**1.345±0.229**6 6 6 6 6

2.2 各组大鼠脑含水量比较

见表3。造模1 d后大鼠脑含水量增高，在第3日脑含水量增高明显。相较同时段假手术组，各组均有显著统计学意义（P＜0.01）。1 d时电项针组脑组织含水量低于模型组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；在3 d时电项针组含水量增高，但仍低于模型组（P＜0.05）。在抑制剂干预两组中，两时间点ZPP-Ⅸ模型组脑组织含水量均高于ZPP-Ⅸ电项针组（P＜0.05）。

表3 各组大鼠脑含水量比较（%，±s）

表3 各组大鼠脑含水量比较（%，±s）

与ZPP-Ⅸ模型组比较，#P＜0.05。下同

组别假手术组模型组电项针组ZPP-Ⅸ模型组ZPP-Ⅸ电项针组3 d 72.96±0.387 81.57±0.815*78.62±0.520*△82.32±0.738*79.78±0.252*#n3 3 3 3 3 1 d 72.85±0.652 78.01±0.510*77.73±0.854*78.49±0.366*78.29±0.291*#

2.3 各组大鼠神经功能缺损评分比较 见表4。造模后1 d对比假手术组，各组神经功能评分均明显增高（P＜0.05），第3天神经功能评分较第1天有升高。对比ZPP-Ⅸ模型组，ZPP-Ⅸ电项针组神经功能评分改善（P＜0.05）。模型组与电项针组比较仍可见神经功能损伤改善趋势（P＞0.05）。

表4 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

表4 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

组别假手术组模型组电项针组ZPP-Ⅸ模型组ZPP-Ⅸ电项针组n6 6 6 6 6 1 d 0.167±0.408 1.667±0.211*1.000±0.408*△2.000±0.258*1.167±0.167*#3 d 0.333±0.516 2.500±0.224 1.667±0.334 2.833±0.167 1.500±0.342#

3 讨 论

中医理论认为头为诸阳之会，六阳经交接于头部，督脉和足太阳经直接络于脑，其他阳经与督脉交会于大椎穴，故通过刺激颈部穴位，激发阳气达到活血化瘀的目的。实验中选取的供血（颈4夹脊穴）、风池两穴位于椎动脉上方，通过疏波刺激调节椎基底动脉、Willis环的血流，进而改善出血后脑功能。临床上，给予电项针干预能够通过改善血流供应、降低血液黏稠度、减缓急性期脑水肿发展等来治疗脑出血，并对认知功能和运动功能损伤症状有明显改善[19-22]。

HO-1是血红素分解成一氧化碳、铁和胆绿素过程中的限速酶，可以在血红素、重金属、生长因子、细胞因子等多种刺激物作用下高度上调。脑出血后，高浓度游离的血红素能够诱导HO-1表达增高，加速血红素分解，减少自由基产生，减轻继发性损伤。HO-1还可以保护内皮细胞防止凋亡，也可以调节血管紧张度，使血管松弛，减轻血管壁炎症反应，同时还能够参与血管生成[23-24]。有研究表明脑出血后，红细胞溶解释放血红素，会消耗细胞内能量储备、激活补体系统[25]，进而导致脑水肿、氧化应激反应、神经元死亡[26]。脑出血后高浓度的游离血红素则促使HO-1表达升高，使血红素分解减轻继发性损伤。

临床研究表明，脑出血后3 d内HO-1表达达到高峰，且与急性期损伤同步[27]，该过程与大鼠脑出血模型研究相一致[28]。有实验发现，脑出血后血肿周围组织HO-1表达升高同时，与TNF-α、IL-1β的表达呈负相关，能够发挥抗炎作用[29]。戴晓红等研究表明，给予脑出血大鼠头针干预能够上调病灶周围HO-1表达，发挥其抗氧化作用，减轻损伤[30]。

本实验中，与假手术组对比，各组HO-1表达均增高且差异具有统计学意义，电项针干预后HO-1表达较模型组增高。在给予ZPP-Ⅸ抑制剂的两组中未见差异，说明电项针能够通过提高HO-1水平来改善出血后损伤。通过脑含水量的测定表明，给予电项针干预的两组均能够抑制脑水肿的发展，并且作用途径不仅限于HO-1通路。神经功能缺损程度评分，表明电项针干预能够改善神经功能缺损，电项针与模型组对比虽然差异未见统计学意义，但可见评分降低，需进一步研究论证。

综上，本实验表明电项针可以提高HO-1表达，抑制脑水肿进展，减轻脑出血后继发性损伤，并且能够改善神经功能损伤，其具体机制需要进一步探究。