水蛭素术区局部外用对兔股动脉切断吻合术后吻合端病理组织学及肢体远端血流的影响※

关健斌 仇永锋 杨利学 梁浩浩

(陕西中医药大学2016级硕士研究生，陕西 咸阳 712046)

断肢再植术是在显微镜下将离断后的肢体进行断端重建，其中包括骨骼、肌腱、血管、神经等组织对接重建，再通断肢的血液供应，以期最大程度恢复残肢生理功能的一类高难度精细手术。虽然随着医学的进步，手术成功率逐渐提高，但一但失败则会出现不可逆转的情况。其中血管危象是断肢再植术失败的主要原因[1]，主要是指显微外科手术中对细小动静脉吻合后，由于吻合口痉挛或血栓栓塞，进而血运受阻，器官组织血液灌注量不足，甚至出现坏死[2]。因此，处理血管危象的关键是避免吻合端血栓形成，减轻炎性反应，抑制体内的抗凝机制。

肝素及罂粟碱等在显微外科手术中的广泛应用，使得血管危象的发生率逐年降低，但也存在不可避免的副作用[3]。随着对水蛭的不断研究，发现其所含的水蛭素属于一种自然的凝血酶抑制剂，是由65个氨基酸残基组成的一条多肽类物质[4-5]。水蛭素可与机体内凝血酶的受体在不借助辅助因子的条件下特异性结合，产生抗凝作用，预防血管吻合端血栓的形成，促进再植术后远端血流的恢复，从而提高远端肢体组织的有效灌注量。有研究发现，天然水蛭素可促进肉芽组织生成，抑制炎症细胞对受损组织的浸润[6-7]。本实验通过观察局部外用水蛭素对断肢再植时吻合端血管通畅率、血栓形成及炎症细胞浸润程度、远端肢体血流灌注及机体凝血功能的影响，以期寻找一种能提高再植肢体成活率的新型无副作用中药提取物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康新西兰白兔48只，雌雄不限，体质量(3.0±0.5) kg，购于西安易诺谷生物科技有限公司，动物合格证号：SCXK(陕)2018-0001，于陕西中医药大学中药协同创新中心实验动物房统一饲养，温度23～25 ℃，湿度50%～70%，饲料由西安交通大学医学实验动物中心提供。

1.1.2 实验试剂 天然水蛭素冻干粉(南宁净雪皇生物工程有限公司)；肝素钠注射液(常州千红生化制药股份有限公司，国药准字H32022088)；活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒[天津美德太平洋科技有限公司，津食药监械(准字2010第2400022号)]；纤维蛋白原(FIB)测定试剂盒[上海长岛生物技术有限公司，沪食药监械(准)字2013第2401010号]；0.9%氯化钠注射液(安徽双鹤药业有限责任公司，国药准字H34023607)；碘伏消毒液[山东利尔康医疗科技股份有限公司，鲁卫消证字(2002)第0059号]；10%水合氯醛溶液(上海山浦化工有限公司)；10%甲醛溶液(上海哈灵生物科技有限公司)；注射用头孢呋辛钠(国药集团威奇达药业有限公司，国药准字H20066954)；苏木素染液(珠海贝索生物技术有限公司)。

1.1.3 实验仪器 经济型连续变倍体视显微镜(SZM-7045型，无锡鑫能达科技有限公司)；显微镜(BX50型，日本OLYMPUS公司)；高速台式离心机(TGL-20B型，上海安亭科学仪器厂)；激光多普勒血流仪(PeriFlux5010型，瑞典Perimed AB公司)；全自动血凝分析仪(C2000-A型，北京普利生仪器有限公司)；电子秤(永康市珠恒电子有限公司)；长毛兔电推剪(T82型，荷兰皇家飞利浦公司)；石蜡切片机(日本SONY公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将48只新西兰白兔按照随机数字表法分为3组，对照组、肝素钠注射液组、水蛭素组，每组16只。

1.2.2 模型制备及给药 分别对新西兰白兔称质量，使用20 mL无菌医用注射器抽取10%水合氯醛溶液，以4.5 mL/kg体质量腹腔注射进行麻醉，之后每小时0.5 mL/kg体质量进行麻醉维持。待兔无抵抗力、角膜反射减弱直到消失时，将兔仰卧位展开，置于操作台上，备皮区域需稍大于手术区域，用长毛兔电推剪将兔左侧后肢及部分腹部毛发推剪干净。备皮完成后用碘伏对手术野进行消毒，采用激光多普勒血流仪探测兔股动脉走行，并用记号笔沿所探测的动脉走行各画1条长约4 cm的纵行手术切口标记(于腹股沟中点切至股骨中下段)。打开无菌手术器械包、显微手术器械包，穿戴无菌手套、无菌手术衣，手术区域进行常规消毒及铺巾，实验过程完全遵守无菌原则。根据之前的手术画线，使用无菌手术刀切开皮肤、浅筋膜直至皮下深筋膜层，用弯钳钝性分离肌肉组织，暴露股动脉鞘，然后分离股动脉、股静脉及股神经。由于10%水合氯醛溶液对周围神经的麻醉效果较差，因此分离出股神经后，将股神经切断，防止术中疼痛引起兔体位改变，甚至休克，导致实验进行困难或失败。用2个显微外科动脉夹夹住股动脉近心端和远心端，阻断股动脉血运，从中间横行切断股动脉(动脉切断点统一为髂外动脉分叉下端1 cm处)，然后检查两断端是否整齐，并修剪血管外膜。对照组用0.9%氯化钠注射液，肝素钠注射液组用肝素钠注射液62.5 U/mL，水蛭素组用天然水蛭素冻干粉液(5 mg天然水蛭素冻干粉∶100 mL 0.9%氯化钠注射液)，各150 mL，由两血管断端冲洗血管腔。然后用10-0尼龙线行原位断端吻合术，保证进针时针尖与血管管壁角度垂直，内膜良好对合前进行缝合，并在吻合口最后一针未打结前，在吻合端处注入相应溶液。完全吻合后，再在吻合端局部分别注射上述对应3组液体各2 mL，观察血管通畅情况，确保再植术模型造模成功，然后用5-0尼龙线逐层缝合伤口。手术完成后，予注射用头孢呋辛钠兔臀大肌注射防止感染。为避免兔之间相互撕咬导致吻合端断裂或伤亡，术后每只兔进行单独分笼饲养。

1.3 观察指标

1.3.1 大体观察 每组术后即刻取16只兔，术后24 h取其中8只兔，术后48 h取余下8只兔，使用20 mL无菌医用注射器抽取10%水合氯醛溶液4.5 mL/kg进行腹腔注射麻醉，待兔角膜反射消失后，打开手术切口，显露吻合端，在显微镜下观察血管管腔的再通情况、周围组织粘连程度、吻合端水肿情况等，再进行血管通畅实验，即用2个显微外科动脉夹夹住股动脉血管断端两侧，将动脉夹所夹血管间的血液排空，然后松开近心端的动脉夹，观察动脉血管是否充盈。

1.3.2 经皮激光多普勒血液灌注检测 采用激光多普勒血流仪的血液灌注监测系统(LDPM)模块[8]对组织内血流灌注量及移动红细胞密度(CMBC)平均值进行量化，其值表示的是灌注单位(PU)。术前将激光多普勒血流仪的Small Straight Probe404探头接触每只兔左侧后肢最末端，测定兔左侧后肢末端血运，并用标记笔在探测点标记，术后24 h、48 h均在此处测定兔左侧后肢末端血运。探测过程中探头触碰组织的同时应保持接触面无压力，并用仪器匹配的双面胶布将探头固定在测定点。探头另一侧连接计算机，通过自带软件得出相关PU值。

1.3.3 病理组织学观察 术后24 h、48 h进行大体观察和肢体末端血运测定后，将血管吻合处的血管段切除(长1 cm左右)，用10%甲醛溶液固定24 h，然后进行组织脱水，将切除的血管段取出，于70%、80%、90%、100%乙醇梯度浸泡，每种浓度浸泡30 min，最后再次浸泡于100%乙醇中30 min。然后进行透明，将所取血管段依次浸泡于二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各30 min。经上述步骤后，进行石蜡浸蜡与包埋，待石蜡凝固后，将蜡块取出，对蜡块进行修正并做标记存放。将石蜡包埋好的血管段固定于切片机上，连续切成4 μm厚度薄片，将切下的血管薄片放于温水中，然后将其轻轻贴附于防脱载玻片上，再将组织切片进行烤片。接着进行苏木素-伊红(HE)染色，具体染色方法如下：将切片进行脱蜡和水化，然后应用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，每次3 min，然后置于蒸馏水中待用。将脱蜡和水化后的组织标本完全浸没苏木素染液中5 min，然后取出用流水冲洗掉切片上的苏木素染液，再完全浸于1%盐酸乙醇溶液中分化脱色，流水再次冲洗切片，然后将切片浸泡入温水中返蓝10 min，再用流水冲洗。将以上切片完全浸于0.5%伊红染色，进行乙醇梯度脱水(同上)，然后进行透明处理，浸入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各1 min。最后进行切片的风干和封片。在显微镜下放大200倍观察组织细胞并进行拍照，观察染色后吻合端周围炎症细胞浸润与组织坏死程度。然后用Image Pro Plus 6.0医学图像处理系统测量血栓占比。

1.3.4 凝血功能检测 术前及术后24 h、48 h，采集每只兔耳缘静脉血1.8 mL，加入枸橼酸钠抗凝剂0.2 mL，进行震荡混合，充分混匀后，用离心机3 000 r/min，离心10 min。采用全自动血凝分析仪检测凝血功能指标APTT和FIB。

2 结 果

2.1 3组兔大体观察 术后即刻，3组兔血管断端处轻度渗血但无血凝块附着于管壁，与周围组织间无任何粘连，吻合端处轻度肿胀，血管呈淡红色，血管通畅实验均为阴性，血管吻合术后通畅率为100%。术后24 h，对照组兔血管断端吻合处血管外壁稍有隆起，部分可见血管断端吻合处有血凝块形成，近端较远端管腔大，血液流速慢，血管通畅实验为弱阳性。肝素钠注射液组、水蛭素组兔血管断端吻合处血管平滑，无血凝块黏附，血管通畅实验均为阴性。术后48 h，对照组兔血管与周围组织稍有粘连，很难进行游离。血管断端吻合处缝合线部分显露，未再通而栓塞，血管内看到血凝块于血管内壁附着，吻合端远端无血流，血管通畅实验为阳性，管腔由于缺乏血液提供营养而变干。肝素钠注射液组、水蛭素组兔血管断端吻合处平滑，无血凝块黏附，血管与周围组织均无粘连，血管壁较术后24 h弹性下降，血管通畅实验为阴性。

2.2 3组兔术后即刻及术后24 h、48 h股动脉血管通畅率比较 见表1。

表1 3组兔术后即刻及术后24 h、48 h股动脉血管通畅率比较 %

与对照组比较，*P<0.05；与肝素钠注射液组比较，△P<0.05

由表1可见，术后即刻，3组兔股动脉血管通畅率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。术后24 h、48 h，肝素钠注射液组、水蛭素组兔股动脉血管通畅率均高于对照组同期(P<0.05)。术后48 h，水蛭素组兔股动脉血管通畅率高于肝素钠注射液组同期(P<0.05)。

2.3 3组兔术后24 h、48 h平均PU值、血栓占比比较 见表2。

对照组术后24 h(n=8)术后48 h(n=8)肝素钠注射液组术后24 h(n=8)术后48 h(n=8)水蛭素组术后24 h(n=8)术后48 h(n=8)PU值2.20±0.401.20±0.50#4.10±1.50∗4.30±1.70△4.30±1.40∗4.40±1.40△血栓占比8.12±1.5311.25±2.935.36±1.35∗7.36±2.15△5.23±1.12∗7.23±1.98△

与对照组术后24 h比较，*P<0.05；与对照组术后48 h比较，△P<0.05；与本组术后24 h比较，#P<0.05

由表2可见，术后24 h、48 h，肝素钠注射液组、水蛭素组平均PU值均高于对照组同期(P<0.05)，血栓占比均低于对照组同期(P<0.05)；肝素钠注射液组与水蛭素组平均PU值、血栓占比比较差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组术后48 h平均PU值低于本组术后24 h(P<0.05)。

2.4 3组兔术前、术后24 h、术后48 h APTT、FIB比较 见表3。

由表3可见，术后24 h、48 h，肝素钠注射液组、水蛭素组APTT均高于对照组(P<0.05)，FIB均低于对照组(P<0.05)；肝素钠注射液组与水蛭素组APTT、FIB比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

对照组术前(n=16)术后24 h(n=8)术后48 h(n=8)肝素钠注射液组术前(n=16)术后24 h(n=8)术后48 h(n=8)水蛭素组术前(n=16)术后24 h(n=8)术后48 h(n=8)APTT(s)24.21±2.8911.28±1.269.23±0.9523.98±3.2928.52±4.33∗33.82±8.01△23.62±3.1929.12±4.67∗34.21±7.86△FIB(g/L)2.62±0.604.52±0.536.35±1.542.55±0.743.52±0.82∗3.35±0.84△2.46±0.793.43±0.71∗3.45±0.87△

与对照组术后24 h比较，*P<0.05；与对照组术后48 h比较，△P<0.05

2.5 3组兔术后24 h、48 h组织病理学观察 术后24 h，与对照组比较，肝素钠注射液组和水蛭素组均可见新生薄壁血管生成，其中水蛭素组最多。3组均可见大量炎症细胞浸润，其中对照组炎症细胞浸润最重，水蛭素组炎症细胞浸润情况最轻。术后48 h，与对照组比较，肝素钠注射液组和水蛭素组均可见较多的新生薄壁血管形成；对照组炎症细胞浸润明显增加，部分细胞内皮细胞出现凋亡、坏死，而肝素钠注射液组和水蛭素组炎症细胞浸润明显较术后24 h减少，炎性反应较对照组轻。见封3，图1。

3 讨 论

断肢再植术后血管危象的成因主要有血管平滑肌收缩导致的血管痉挛。由于伤后情绪刺激导致血管紧张素增多[9]，同时交感神经兴奋，其末梢释放大量去甲肾上腺素等化学递质，引起全身大小动静脉处于持续紧张状态，造成肢体远端血流灌注不足，甚至血运消失[10]。另外，疼痛刺激促使受损组织细胞释放多重内源性致痛物质，刺激全身动静脉引起血管收缩，导致痉挛[11]。血管内膜损伤是另一大主要因素，血管内膜损伤后，其抗凝血系统平衡被打破，促使内膜分泌大量的血栓素B2(TXB2)、内皮素，以及降低血管内皮生长因子(VEGF)的表达，造成血管吻合处血栓堆积，从而导致再植术后远端肢体血运障碍。肝素钠主要通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合，而增强后者对活化的凝血因子Ⅱ、Ⅸ、X、Ⅺ和Ⅻ的抑制作用，从而阻止血小板凝集，阻止凝血酶原变为凝血酶，抑制纤维蛋白原变成纤维蛋白，发挥体内和体外抗凝作用。已有研究证实，局部应用天然水蛭素能降低TXB2、血管内皮素(ET)含量，减少血栓形成，提高VEGF的表达，促进新生薄壁毛细血管形成[12]。由于损伤，损伤部位和周围组织会合成并释放大量凝血酶、炎症因子，从而激活凝血系统和炎性反应，产生一系列病理变化，抑制吻合端修复[13]。天然水蛭素通过抑制凝血酶的相关信号通路，减少血栓形成，调节VEGF与血管生成拮抗因子之间的动态平衡，抑制炎性反应，最终对断肢再植术后的血管危象达到预防作用[14-15]。

本实验中通过LDPM模块对组织内血流灌注量及CMBC平均值进行量化，即PU值进行比较。结果显示，术后24 h，肝素钠注射液组、水蛭素组PU值均高于对照组(P<0.05)。术后48 h，肝素钠注射液组、水蛭素组PU值稳定于术后24 h水平，而对照组有下降趋势(P<0.05)。通过大体观察股动脉血管通畅率，肝素钠注射液组和水蛭素组术后24 h、48 h均高于对照组(P<0.05)，且术后48 h水蛭素组高于肝素钠注射液组(P<0.05)。说明天然水蛭素可以更长期发挥与肝素钠注射液相同的作用，提高吻合血管术后血管通畅率，有效预防肢体末端血运障碍。

通过HE染色观察切片中各炎症细胞的浸润情况，显示对照组术后24 h、48 h炎症细胞浸润高于肝素钠注射液组和水蛭素组；对照组血管吻合端血栓占比高于肝素钠注射液组和水蛭素组同期(P<0.05)。凝血功能监测结果表明，术后24 h、48 h对照组APTT均低于肝素钠注射液组和水蛭素组同期(P<0.05)，FIB均高于肝素钠注射液组和水蛭素组同期(P<0.05)；而肝素钠注射液组和水蛭素组趋于正常值，比较差异无统计学意义(P>0.05)。说明水蛭素能通过抑制体内凝血机制和降低炎性反应来抑制血栓形成。

综上所述，天然水蛭素具有良好的抑制血管吻合端血栓形成、降低炎性反应的作用。通过HE染色观察，在抑制炎性反应的效果上，优于肝素钠注射液组；在预防血栓形成、抑制凝血系统、恢复肢体远端血运的作用上与肝素钠注射液组相似。说明天然水蛭素既有预防吻合端血栓形成、抑制凝血系统、恢复肢体远端血运的作用，又能抑制炎性反应造成的应激。