白藜芦醇抑制巨噬细胞中NF-κB通路发挥抗肝纤维化作用

闫玉栋，姜海行，罗 薇，胡榜利，于 冰，李 凡，付艳君

1.广西医科大学第一附属医院消化内科，广西 南宁 530021； 2.广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部； 3.广西医科大学第二附属医院消化内科；4.湖南省长沙市第四人民医院药剂科; 5.桂林医学院附属医院

研究[1]表明，肝纤维化的进程离不开固有免疫的参与，而广泛散布于人体各组织、脏器,巨噬细胞是其重要的一份子，它们利用自身免疫特性可影响肝纤维化的进展。巨噬细胞因其有高度可塑性为人熟知，在脂多糖(LPS)所致的炎性环境下，其可转变为经典活化型(M1)，而IL-4营造的抗炎环境可促其分化为替代活化型(M2)。这两种不同类型的巨噬细胞，在疾病发展过程中起到不同作用[2]，巨噬细胞在肝脏炎症和纤维化形成过程中，扮演核心角色[3]，以上两种类型巨噬细胞可通过不同途径，影响肝纤维化进展，M1型巨噬细胞可通过增加肝脏星状细胞的凋亡和对内源性巨噬细胞的募集作用，改善CCl4肝纤维化小鼠的肝脏纤维化[4]，巨噬细胞可被间充质细胞诱导向M2型转化，并改善肝纤维化[5]。白藜芦醇是一类多酚类化合物，具有良好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性等药理作用[6]，研究表明LPS诱导的巨噬细胞炎性反应可被白藜芦醇显著降低，其主要途径是抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等致炎因子的表达，促进LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞向其M2型转化[7]。

既往研究发现，白藜芦醇具有抑制大鼠肝星状细胞增殖作用，通过抑制肝星状细胞和抗氧化作用来发挥抗肝纤维化作用[8]，有研究证实M1型巨噬细胞可被白藜芦醇诱导为M2型，抑制小鼠肝纤维化进展[9]，提示白藜芦醇通过改变巨噬细胞极化方向，以达到抗肝纤维化作用，但其机制尚未阐明。NF-κB通路是已经被证实的炎症反应和细胞免疫中的重要通路之一，肝纤维化的发病过程也有它的参与[10]，阻断TLR4/MyD88/MAPK/NF-κB可改善肝纤维化小鼠的肝脏纤维化情况[11]，NF-κB作为该通路上的关键炎症因子之一，便于检测且对调节炎症走向非常重要。然而，目前尚不清楚白藜芦醇是否通过这种途径抗肝纤维化，本研究将进行体内和体外实验，通过抑制肝组织M1型巨噬细胞内的NF-κB通路来明确白藜芦醇是否可经该通路抗肝纤维化。

1 材料与方法

1.1 材料BALB/C小鼠18只(雄性、健康)，体质量20～22 g，6～8周龄(购自广西壮族自治区动物中心)。CCl4(上海国药集团)、白藜芦醇粉剂(上海TCI 公司)、橄榄油(上海国药集团)、Masson三色染色试剂盒(南京建成科技公司)、胎牛血清(美国 GIBCO)、DMEM 培养基(美国 GIBCO)、4%多聚甲醛固定液(北京索莱宝科技有限公司)、脂多糖(美国 SIGMA)、磷酸盐缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)、青链霉素混合液(100×)(北京索莱宝科技有限公司)，30%丙烯酰胺、pH8.8 HCl(北京索莱宝科技有限公司)、pH6.8 HCl(北京索莱宝科技有限公司)、过硫酸铵(北京索莱宝科技有限公司)、TEMED(美国Sigma公司)，PVDF膜(美国Merck Millipore公司)，RAW264.7 细胞系(购自美国 ATCC)。柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒(上海生物工程公司)、Real-time qPCR 试剂盒(Takara 宝生生物工程有限公司)，5×蛋白上样缓冲液(北京索莱宝科技有限公司),一抗稀释液、二抗稀释液(北京索莱宝科技有限公司)，玻璃板、制胶架、电源、电泳槽、转膜槽(美国伯乐公司)，NF-κB抗体(兔抗，美国CST公司)、二抗(兔抗700W Licor公司)。

1.2 建立各组小鼠模型小鼠按随机原则分为3组，每组6只。分别予橄榄油、橄榄油+CCl4、橄榄油+CCl4+白藜芦醇腹腔内注射，橄榄油和CCl4用量为2 mg/kg，白藜芦醇用量为400 mg·kg-1·d-1[12]，CCl4溶于橄榄油中，浓度为10%；白藜芦醇均匀混于橄榄油中，20 g/L，用法及造模时间均为2次/周，持续5周，造模过程中干预组动物死亡2只。

1.3 小鼠标本留取造模满5周后，将小鼠麻醉后采眶动脉及眶静脉血，4 ℃静止放置3 h后离心(2 000 r/min，5 min)，留上清-80 ℃存放。然后剪开小鼠腹部皮肤及腹膜，暴露下腔静脉和肝门静脉，用磷酸盐缓冲液(PBS)经肝脏门脉进行灌注，至肝脏颜色发白，剪破下腔静脉，反复冲洗，充分释放肝内血液，将整个肝脏完整取下。部分肝脏先于液氮内放置5 min，再转-80 ℃存放，其余肝脏固定于10%甲醛溶液中。

1.4 Masson检测肝组织纤维化组织固定24 h后，依次经水洗、脱水、透明及包埋等处理后切片(片厚3～4 μm)。切片后常规脱蜡、水化；按说明书依次滴加试剂A-Masson、C-磷钼酸、D-苯胺蓝、B-分化液等，再经脱水、透明、封片后，即可观察、摄片。采用Masson三色染色法进行肝脏胶原纤维染色，用CMIAS 图像分析系统来分析Masson图像。

1.5 LPS诱导M0巨噬细胞极化先用含10%FBS的DMEM培养基孵育RAW264.7巨噬细胞18 h，再在无血清培养基内中性培育24 h后，分为PBS对照组、LPS(100 ng/ml)组、LPS(100 ng/ml)+白藜芦醇(30 μmol/L)组，前两者分别刺激24 h，最后一组用LPS刺激24 h后，再加入白藜芦醇刺激24 h，将细胞及其上清液分开收集，用于后续各项指标的检测。

1.6 RT-PCR检测NF-κB mRNA表达量采用Trizol法提取细胞总RNA。用琼脂糖凝胶电泳验证总RNA提取质量，用紫外分光光度计测定总RNA水平。将总RNA逆转为cDNA(37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s)，然后进行加样、扩增，扩增采用Applied biosystems 7500进行，采用两步法标准扩增程序，所用基因引物由上海Invitrogen公司提供，NF-κB核苷酸序列引物见表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer of sequence

1.7 Western blotting检测NF-κB蛋白表达量利用裂解液裂解小鼠肝脏,超声波室温匀浆0.5～1 min，然后4 ℃，14 000×g离心 5 min。取上清液获得蛋白样品，按1∶4比例加入5×蛋白上样缓冲液沸水中煮15 min充分变性。依次经电泳、转膜、洗膜、室温封闭、洗膜、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜、红外荧光扫膜仪等步骤，获得目的条带，对所获条带进行量化分析。

1.8 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，三组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇能抑制小鼠肝纤维化进展Masson染色结果显示，使用CCl4腹腔注射造模后，在第5周白藜芦醇干预组肝纤维化程度较CCl4组明显减轻，提示其可改善肝纤维化(见图1)。

注：A： 各组小鼠肝组织的Masson染色， 胶原纤维呈蓝色，细胞核呈蓝褐色， 细胞质、肌纤维及红细胞呈红色，CCl4组及白藜芦醇干预组可见大量肝细胞变性、坏死，肝脏原有结构破坏，纤维增生明显，箭头所指位置可见假小叶形成，CCl4组最为明显， 白藜芦醇干预组次之，正常组无(放大200倍)；B：各组小鼠第5周肝组织Masson染色累积光密度值比较。与正常对照组比较，**P<0.05。

2.2 白藜芦醇能降低肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB mRNA表达水平RT-PCR法测定各组动物肝组织中NF-κB1 mRNA含量，CCl4组NF-κB mRNA的表达量较正常组高，白藜芦醇干预后的肝纤维化模型小鼠肝组织中的NF-κB mRNA表达水平较CCl4组下降(见图2)。

2.3 白藜芦醇能降低肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB蛋白表达分离提取肝组织中的蛋白后，Western blotting检测显示，肝纤维化组织中的NF-κB蛋白表达水平比正常肝组织的表达水平明显升高，而使用白藜芦醇干预小鼠肝纤维化模型后，肝组织表达的NF-κB蛋白较CCl4组显著下降(见图3)。

2.4 白藜芦醇能抑制M1型巨噬细胞中NK-κB mRNA表达RT-PCR法检测各组巨噬细胞模型中NF-κB mRNA结果显示，NF-κB mRNA表达量由高到低依次为M1>M1+白藜芦醇>M0(见图4)。

注：与正常对照组比较，*P<0.05, **P<0.01。

注：与正常对照组比较，*P<0.05, **P<0.01。

图4 白藜芦醇可抑制M1型巨噬细胞内NF-κB mRNA表达Fig 4 Expression of NF-κB mRNA in M1-type macrophages inhibited by Resveratrol

2.5 白藜芦醇可抑制M1型巨噬细胞中NF-κB蛋白的表达Western blotting数据提示，M1型巨噬细胞产生的NF-κB蛋白量高于M0型，而白藜芦醇干预M1型巨噬细胞使其NF-κB蛋白水平下降，提示其可抑制NF-κB蛋白表达(见图5)。

3 讨论

多种慢性肝病导致肝纤维化成为我国高发病之一，随之而来的肝硬化严重危害国民健康。研究表明，肝纤维化的加重伴随肝内M1型巨噬细胞和炎症细胞数量上升，而M2型巨噬细胞数量变化与M1型相反；肝纤维化的缓解伴随肝内炎性细胞数量下降，M1型巨噬细胞数量随肝纤维化缓解而下降，而M2型则相应增多；不难看出,M2型巨噬细胞改善肝纤维化，而M1型巨噬细胞加速肝纤维化进展[13]。

注：与M0巨噬细胞比较，*P<0.05, **P<0.01。

白藜芦醇在哺乳类动物体内生物利用度相对较低，主要以结合形式分布在肝脏、肾脏、心脏和脑等血流灌注丰富的器官，其他组织也有分布[14]。既往的体外细胞实验表明，白藜芦醇可促进M0型巨噬细胞转化为M2型，并强化白介素10(IL-10)等抗炎因子的释放，以减缓肝纤维化进展[9]。本研究在小鼠肝纤维化模型中使用白藜芦醇干预后，发现肝组织纤维化程度明显改善，与既往报道结果相符。

已有研究提示，白藜芦醇是利用其对多条信号通路的调控来实现其抗炎及免疫调节功能，有文献报道其可通过降低NF-κB通路活化来缓解炎症反应。El-Sheikh等[15]发现白藜芦醇对环磷酰胺诱导的多器官毒性的保护作用可能与抑制NF-κB/TNF-α途径有关。而NF-κB通路已被证实与肝纤维的发病密切相关，一些药物可以通过抑制该通路发挥抗肝纤维化作用。

本研究中，肝纤维化模型中NF-κB通路活性明显增高，用白藜芦醇抑制该通路活性后，肝纤维化情况得到改善，巨噬细胞模型检测结果提示，白藜芦醇可能是通过抑制肝纤维化小鼠肝内M1型巨噬细胞的NF-κB通路活性来延缓肝纤维进程。

综上所述，白藜芦醇延缓肝纤维化的作用机制之一为抑制肝内M1型巨噬细胞中NF-κB通路的活性。