外源NO对铅胁迫下鸡爪大黄种子萌发及幼苗生理特性的影响

王桠楠， 茹 刚， 武国凡

(西北师范大学生命科学学院， 甘肃 兰州 730070)

鸡爪大黄(原变种)又名唐古特大黄(RheumtanguticumMaxim.ex Regel)，为蓼科大黄属多年生高大草本植物，生于海拔2 500～3 500 m高山沟谷或林下，产于甘肃、青海及西藏一带，其根状茎及根内含大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素等[1]，可供药用，具有攻积导滞、泻火解毒、凉血止血的功效。目前对鸡爪大黄的研究主要集中在其化学成分、存在部位及药理作用分析，章英才等研究了六盘山鸡爪大黄根和根茎醌类化合物的存在部位，结果表明，蒽醌娄化合物存在于根和根茎中，维管射线是其贮藏和积累的主要组织[2]；他们还研究了多糖的贮藏分布特征，结果表明，鸡爪大黄多糖主要分布在根茎中，且薄壁细胞是其贮藏和积累的主要部位[3]。另外，赵建军等[4]总结了甘南高寒冷区鸡爪大黄栽培技术，播种前将种子在18～20 ℃的温水中浸种 6～8 h并施加氮、磷、钾含量各10%的复合肥可提高鸡爪大黄产量。

近年来，随着社会经济的不断发展，由工业和农业所产生的各种重金属经河流排放而导致土壤污染日益剧增，据统计，我国约有2 000万hm2的耕地面积受到了不同类别和不同程度的污染，大约占耕地面积的1/5[5]。不论是农作物种植还是药材种植都会通过食物链富集对人体造成重大的伤害。在药材种植业中，中国大黄驰名中外，在西部，大黄主要分为2个品种，其1个是掌叶大黄，另一个是它的变种俗称鸡爪大黄，鸡爪大黄的栽培相对比较广泛，但栽培的鸡爪大黄受超标重金属Pb2+的胁迫。本研究以甘肃省河西走廊中部的金昌市金川河两岸为研究地点，该区域重金属铅(Pb)、铜(Cu)、汞(Hg)、锌(Zn)等含量分布可高达654、3 756、359、442 mg·kg-1，重金属Pb2+含量明显超标[6]。因此如何减小重金属Pb2+对鸡爪大黄的胁迫程度迫在眉睫。

NO作为信号分子可抵御重金属污染，如刘柿良研究表明，对白车轴草施加适宜浓度外源NO能有效地缓解重金属胁迫而造成的毒害，其机理是通过降低氧化损伤，激发细胞内NO的重新合成，再次确立ATP活性水平及使得因胁迫引起的相关激素含量再次达到平衡[6]。王逸筠等研究表明，外源NO可缓解Cu、Cd对番茄的胁迫[8]。景媛媛等研究表明，低浓度的外源NO供体硝普钠SNP可缓解干旱胁迫对扁蓿豆(Medicagoruthenica)种子萌发和幼苗生长的影响，提高了扁蓿豆种子的发芽指数、活力指数、发芽率和发芽势[9]。

目前，外源NO处理能否有效缓解重金属Pb2+胁迫对鸡爪大黄种子萌发和幼苗的正常生长未见报道，本研究以鸡爪大黄种子和幼苗为材料，探讨了外源NO如何调节重金属Pb2+胁迫下抗氧化酶活性的变化，以及对鸡爪大黄幼苗膜系统的稳定性、渗透调节物质含量有何影响，以期丰富重金属Pb2+胁迫下外源NO通过调节抗氧化酶活性及细胞渗透调节物质含量来缓解逆境胁迫因子对药用植物生理学代谢的迫害作用，拓展外源NO提高鸡爪大黄幼苗抗逆性的应用研究。

1 材料与试剂

实验所用鸡爪大黄种子(由西北师范大学生命科学学院武国凡副教授鉴定为鸡爪大黄)于2018年10月份采自甘肃省平凉市六盘山(106°22′48″N，37°52′36″E)，氯化铅(PbCl2)及外源NO供体SNP购自天津市北辰方正试剂厂。

2 实验设计与方法

2.1 实验设计

1) 选取大小均匀、饱满干燥的鸡爪大黄种子50粒，然后用2%的次氯酸钠溶液消毒20 min，再用清水冲洗5次，以蒸馏水为对照，用50、150、300、600、1 200 mg·L-1的PbCl2溶液浸种24 h，每组实验重复3次。浸种处理完成后，将种子置于9 cm垫有双层滤纸的培养皿中，在SPX-150-GB型光照培养箱中培养萌发(温度：20 ℃，光周期：12 h黑暗/12 h光照，光强：4 000 lx，湿度：50%)直到第1粒种子萌发，以芽长为种子长度的1/2为发芽标准。每天统计发芽率，测量根长并计算发芽势、活力指数。

2) 参照以上方法用蒸馏水培养7组鸡爪大黄幼苗，待幼苗的2片子叶完全伸展开后，1组叶面喷施蒸馏水作为未胁迫对照，剩余6组叶面喷施600 mg·L-1PbCl2溶液进行处理，5 d后对这6组处理分别施加浓度为0、50、100、200、500、1 000μmol·L-1的外源NO供体硝普钠溶液进行缓解(每天喷施相应浓度SNP溶液，确保幼苗叶片湿润即可)。待5 d后测定MDA、Pro、叶绿素(a+b)含量、REC、SOD、POD活性。

2.2 实验方法

MDA含量测定参照刘家尧等[10]的硫代巴比妥酸法；Pro含量的测定采用茚三酮比色法[11]；叶绿素(a+b)含量的测定按照Arnon[12]的方法；REC的测定参照王学奎[13]的方法；SOD活性参照李合生[14]的方法，POD活性使用愈创木酚测定法[14]。

2.3 数据统计与分析

采用SPSS 20.0软件统计分析，使用Origin 8.50软件作图。

3 结果与分析

3.1 不同浓度的PbCl2溶液对鸡爪大黄种子萌发及幼苗生长的影响

以蒸馏水为对照，使用不同浓度PbCl2溶液浸种处理鸡爪大黄种子24 h。随着处理溶液浓度的增大，种子的发芽率、发芽势、活力指数整体呈下降趋势(图1)。当PbCl2溶液浓度小于150 mg·L-1时，浸种处理对种子的发芽率、发芽势较对照组没有显著性差异(p>0.05)，而活力指数较对照组显著下降，说明幼苗根长显著受到抑制作用，即幼苗对PbCl2溶液胁迫相对种子较为敏感。当PbCl2溶液浓度大于150 mg·L-1时，随着处理溶液浓度的增大，种子的发芽率、发芽势、活力指数连续下降，当PbCl2溶液处理浓度为1 200 mg·L-1时完全抑制鸡爪大黄种子的萌发。表明高浓度的PbCl2溶液对鸡爪大黄种子萌发及幼苗的生长具有很强的抑制作用。

图1 不同浓度的PbCl2溶液对鸡爪大黄种子的发芽率、发芽势、活力指数的影响

3.2 外源NO对PbCl2溶液胁迫下幼苗生理特性的影响

3.2.1不同浓度的外源NO对PbCl2溶液胁迫下幼苗MDA含量的影响

选择未受到胁迫的一组鸡爪大黄幼苗作为第1个对照(ck0)，600 mg·L-1PbCl2溶液胁迫而未进行缓解的鸡爪大黄幼苗作为第2个对照(ck1)。ck1较ck0MDA含量显著上升(p<0.05)，但随着SNP溶液处理浓度的提高，MDA含量先降低后升高(图2)。SNP溶液处理浓度为200μmol·L-1时，鸡爪大黄幼苗体内MDA含量降到最低，较ck1降低了50.40%，与ck0相比，MDA含量无显著性差异(p>0.05)。此后，随着SNP溶液处理浓度的继续提高，鸡爪大黄幼苗体内MDA含量又逐渐上升，当SNP溶液处理浓度达到1 000μmol·L-1时，MDA含量显著高于其他各处理组(p<0.05)。

图2 SNP溶液对MDA含量的影响

3.2.2不同浓度的外源NO对PbCl2溶液胁迫下幼苗体内SOD、POD活性的影响

(2) 由轴箱弹簧引起的偏差ΔB1与ΔB2。根据弹簧串联定律可知，将一个刚度为K、原长为L1的弹簧与一个刚度无穷大、原长为L2的弹簧串联，串联后的弹簧刚度为K，原长为L1+L2。因此，在轴箱弹簧处加设垫片，等效于改变轴箱弹簧的原长。因此，这部分偏差可通过在轴箱弹簧处加设垫片来减小。

1) 幼苗体内SOD活性的变化。

未受到PbCl2溶液胁迫的ck0组鸡爪大黄幼苗体内SOD活性相对较低，幼苗遭受PbCl2溶液胁迫的ck1组SOD活性较ck0组显著升高(p<0.05)。对鸡爪大黄幼苗施加不同浓度的SNP溶液进行处理，发现随着SNP溶液处理浓度的增大，鸡爪大黄幼苗体内SOD活性先升高后降低(图3)。当SNP溶液处理浓度为200μmol·L-1时，SOD活性达到峰值，较ck1提高了60.98%(p<0.05)。当SNP溶液浓度高于200μmol·L-1，随着溶液浓度的提高SOD活性逐渐下降。表明适宜浓度的外源NO可提高植物体内SOD的活性，从而可消除植物体内积累过多的活性氧(ROS)。

图3 SNP溶液对SOD活性的影响

2) 幼苗体内POD活性的变化。

鸡爪大黄幼苗遭受PbCl2溶液胁迫后，未施加SNP溶液缓解的ck1组较未受到PbCl2溶液胁迫的ck0组幼苗体内POD活性略微降低但不显著(p>0.05)。当对鸡爪大黄幼苗施加不同浓度的SNP溶液进行处理，发现随着SNP溶液处理浓度的增大，鸡爪大黄幼苗体内POD活性先升高后降低(图4)。当SNP溶液处理浓度为200μmol·L-1时，POD活性达到峰值，较胁迫而未受到SNP溶液缓解的ck1组提高了454.87%(p<0.05)。当SNP溶液浓度高于200μmol·L-1时，随着溶液浓度的提高POD活性逐渐下降。表明适宜浓度的外源NO可调节植物体内在逆境条件下POD的活性，从而消除植物体内积累过多的H2O2等有毒物质。

图4 SNP溶液对POD活性的影响

3.2.3不同浓度的外源NO对PbCl2溶液胁迫下幼苗叶绿素(a+b)含量的影响

PbCl2溶液胁迫后未施加SNP溶液缓解的ck1组幼苗体内叶绿素(a+b)含量较未受到胁迫的ck0组幼苗体内叶绿素(a+b)含量显著下降(p<0.05)。对PbCl2溶液胁迫后的幼苗施加不同浓度的SNP溶液，发现随着SNP溶液处理浓度的提高，幼苗体内叶绿素(a+b)含量先升高后降低(图5)。在SNP溶液处理浓度为200μmol·L-1时，叶绿素(a+b)含量较其它各处理组显著提高，较胁迫而未缓解的ck0组叶绿素(a+b)含量提高了86.00%(p<0.05)。当SNP溶液浓度高于200μmol·L-1时，鸡爪大黄幼苗体内叶绿素含量又逐渐下降，可能是由于高浓度的NO分子的毒性作用抑制了叶绿素的合成。

图5 SNP溶液对叶绿素(a+b)含量的影响

3.2.4不同浓度的外源NO对PbCl2溶液胁迫下幼苗Pro含量的影响

未受到胁迫的ck0组幼苗体内Pro含量相对较低，遭受PbCl2溶液胁迫后的ck1组Pro含量显著上升(p<0.05)。对PbCl2溶液胁迫后的幼苗施加不同浓度的SNP溶液，发现随着SNP溶液处理浓度的提高，幼苗体内Pro含量先升高后降低(图6)。在SNP溶液处理浓度为200μmol·L-1时，Pro含量较其它各处理组显著提高，较胁迫而未缓解的ck1组Pro含量提高了341.97%(p<0.05)。当SNP溶液浓度高于200μmol·L-1时，鸡爪大黄幼苗体内Pro含量又逐渐下降。表明适宜浓度的外源NO可通过提高渗透调节物质游离脯氨酸的含量来维持细胞与环境间的渗透平衡。

图6 SNP溶液对脯氨酸含量的影响

3.2.5不同浓度的外源NO对PbCl2溶液胁迫下幼苗REC的影响

未受到PbCl2溶液胁迫的ck0组幼苗REC较低，当遭受PbCl2溶液胁迫后的ck1组幼苗REC显著性上升(p<0.05)。对PbCl2溶液胁迫后的幼苗施加不同浓度的SNP溶液，发现随着SNP溶液处理浓度的提高，幼苗REC先降低后升高(图7)。在SNP溶液处理浓度为200μmol·L-1时，幼苗REC较其它各处理组显著降低，较胁迫而未缓解的ck1组REC降低了65.22%(p<0.05)。当SNP溶液浓度高于200μmol·L-1时，鸡爪大黄幼苗REC又逐渐下降。表明适宜浓度的外源NO可缓解重金属胁迫对细胞膜的破坏，从而减少了细胞内电解质物质大量外渗。

图7 SNP溶液对电导率的影响

4 讨论与结论

植物在生长发育过程中会遭受不同类型的生物胁迫，如干旱、洪灾、高温、冻害、盐度、重金属污染等，于是植物在漫长的进化过程中形成了一系列复杂的预防机制来应对不良环境对其造成的伤害[15]。但是当生物胁迫超过植物的一定耐受范围就会导致植物的死亡。种子萌发是植物生活史的起点，也是植物感知外界环境条件最初生命阶段，对重金属污染最为敏感。很多研究报道，重金属胁迫对植物的种子萌发及幼苗生长具有不同的影响，重金属胁迫主要通过抑制植物细胞的分裂和伸长，进而激活或者抑制某些酶的活性，从而阻止蛋白质的合成，最终影响植物的呼吸作用和光合作用等生理代谢过程[16]。王丹等[17]报道高浓度的(>200 mg·kg-1)Cu对白菜幼苗的生长具有抑制作用，且随着Cu浓度的不断增大抑制作用逐渐增强。Zn对田箐幼苗进行胁迫后与对照组相比其生长量显著减少了25.2%[18]。

该实验首先使用不同浓度(0、50、150、300、600、1 200 mg·L-1)的PbCl2溶液对鸡爪大黄浸种(24 h)进行培养萌发，测试重金属铅对鸡爪大黄的抑制效应，结果表明：随着PbCl2溶液处理浓度的增大，鸡爪大黄种子的发芽率、发芽势、活力指数均不同程度地下降，最后完全抑制鸡爪大黄种子的萌发。经多次实验，过低浓度的PbCl2溶液处理鸡爪大黄幼苗后各项生理指标较对照组无显著性差异(p>0.05)，而过高浓度的PbCl2溶液处理使得鸡爪大黄幼苗叶片腐烂甚至出现死苗现象，故而该实验选择中间浓度为600 mg·L-1的PbCl2溶液对鸡爪大黄幼苗进行胁迫处理，既能保证幼苗的存活又可体现出各项生理指标较对照组的显著变化，从而通过施加外源NO来判断是否对幼苗的各项生理指标起到明显的缓解作用。

MDA是由O2·-引发的膜脂过氧化最终产物，该实验鸡爪大黄幼苗遭受PbCl2溶液胁迫后MDA含量大量积累，最佳浓度(200μmol·L-1)SNP溶液处理鸡爪大黄幼苗不仅减少了MDA的生成，并且提高了SOD、POD的活性，其机理是适宜浓度的外源NO中断了ROS诱发的链式反应及诱导抗氧化酶活性的升高，减弱了ROS的氧化损伤来避免细胞中不饱和脂肪酸的双键被氧化，从而减少了MDA的生成[19]。本实验研究结果与赵奕翔[20]的研究结果相吻合，赵奕翔探究了外源NO对盐胁迫下玉竹光合作用及抗氧化保护系统的影响，结果表明：外施NO可以提高玉竹幼苗体内抗氧化保护酶的活性，降低了MDA含量，提高了抗氧化保护酶的活性及渗透调节物质含量。幼苗受到胁迫后植物体内SOD活性升高是为了清除胁迫产生的超氧自由基，SOD通过催化O2·-发生歧化反应生成H2O2和O2，H2O2进一步被POD和CAT清除，这也是植物在长期进化过程中产生的一种自我保护的本能。与此同时，经200μmol·L-1SNP溶液缓解幼苗后发现，叶绿素(a+b)含量、Pro含量显著增加，REC显著降低，这与Yu等[21]的研究结果吻合，表明适宜浓度的外源NO增强了幼苗在逆境胁迫下叶绿素的合成，提高了渗透调节物质Pro的含量。Pro作为可溶性物质是植物体内组成蛋白质的主要成分之一，以游离的状态广泛存在于植物体内，因此植物可以通过累积Pro的含量来调节细胞的渗透平衡。REC显著降低意味着细胞膜得到了有效的保护，避免大量可溶性物质及导电性离子外渗。

结论：最佳浓度(200μmol·L-1) SNP溶液可提高鸡爪大黄幼苗体内抗氧化酶活性，增强幼苗ROS清除能力，降低细胞膜过氧化程度，增强细胞膜稳定性，进而抵御重金属Pb2+对药用植物鸡爪大黄幼苗的毒害。从而减少重金属Pb2+在药材中的富集量，达到增加药材产量、优化药材品质、提高农民经济收入的目的。