60Co-γ辐照对方竹种子萌发特性影响的初步研究

龙治坚， 郑 升， 陈小军， 邵征绩， 任 鹏， 徐 刚， 黎 青， 胡尚连

(1.西南科技大学竹类研究所， 四川 绵阳 621010；2.西南科技大学生命科学与工程学院， 四川 绵阳 621010；3.四川省农业科学院生物技术核技术研究所， 成都 610066)

竹亚科(Bambusoideae)是禾本科植物适应森林生境的一个主要分支，与早熟禾亚科(Pooideae)和稻亚科(Oryzoideae)共同组成BOP支系[1]。竹亚科植物大部分种类存在木质化，而且植株高大、生长迅速，但营养生长周期长达几十年，甚至100多年[2]。我国拥有丰富的竹类资源，且对竹资源的研究、开发和利用均处于领先地位，素有“竹子王国”之美誉[2,3]。竹类植物开花后即成片死亡和营养生长周期的特殊生长习性给传统的杂交育种带来了诸多困难，影响了竹类植物新种质的创制和培育，制约了竹的研究与应用。和其他植物相比，竹类植物的育种和种质创制严重滞后，而且主要集中在化学诱变和组培诱变上[4-7]，在物理诱变育种方面则相对较少[8]。这与我国研究竹、产竹、用竹的大国地位不相符合，有必要加大竹类新种质创制与培育的力度。

辐射诱变是物理诱变育种的常用技术方法之一。该技术因其变异频率高、变异谱大、可稳定遗传后代、育种年限短等特点而具有广阔的应用前景[9-11]。其中，60Co-γ是辐射诱变常用的辐射源，具有穿透力强、突变率高等特点，易于使植物在分子、细胞和植株水平上发生变异[9]，已应用于月季[9]、胡麻[12]、澳洲坚果[13]、洋紫荆[14]等植物，从而获得有价值的新突变体，选育出一系列的优良品种。鉴于此，本实验以方竹种子为对象，研究不同60Co-γ剂量辐照下种子的萌发特性，以期探寻方竹种子的半致死辐照剂量，为竹类植物辐照诱变育种和新种质创制提供可能的理论或经验借鉴。

1 材料与方法

1.1 材 料

2019年4月，在四川省宜宾市兴文县仙锋乡(28°12′26″55 N，105°11′48″E)天然开花结实的方竹林里采集新鲜种子。种子采收后，装入网袋，置于低温箱内迅速带回四川省农业科学院生物技术核技术研究所进行辐照处理。

1.2 方 法

1.2.1百粒重的测定

随机选取100粒方竹种子，用万分之一电子天平准确称量百粒重，共3组。在每组中，随机选取20粒种子，用游标卡尺精准测定方竹种子的长度和直径，并记录相应的数据。

1.2.2种子的辐照处理

选取颗粒饱满、大小一致、发育良好的种子，在四川省农业科学院生物技术核技术研究所的60Co-γ实验室进行辐照处理。试验设置6个水平：0 Gy(对照)、10 Gy、20 Gy、30 Gy、40 Gy和50 Gy，剂量率为1.40Gy·min-1。每个水平重复3次，每次100粒种子。

1.2.3种子的萌发与统计

每个60Co-γ处理水平进行3次重复，每个重复50粒种子。种子萌发在培养皿中进行，将种子放入铺有2层滤纸的培养皿，加入10 mL蒸馏水；盖上培养皿，用封口膜封好，置于25 ℃的光照恒温培养箱中进行试验。每间隔48 h，适当给培养皿补充蒸馏水。光照/黑暗周期为12 h/12 h依次交替，光照强度为2 000 lx。

1.2.4数据处理

每24 h统计种子的萌发情况。发芽率(%)、发芽势(%)、相对发芽率(%)、发芽指数、活力指数等萌发特性指标检测参照杜艳等[15,16]的方法。萌发结束后，测量幼苗的根长和芽长，并移栽到营养盘培养，统计成苗率。

1.2.5数据的统计与分析

利用Microsoft office Excel 2016软件对数据进行统计和分析，用Graph Pad Prism 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 方竹的百粒重

采自于四川省宜宾市兴文县仙锋乡的方竹种子，百粒重为(17.279 3±1.923 4)g。种子的长度为(13.23±0.30)mm，宽度为(5.72±0.03)mm。

2.2 不同60Co-γ剂量辐照对方竹种子萌发特性的影响

60Co-γ辐照处理种子，可不同程度地影响种子的萌发进程和出苗的一致性[12]。结果(图1)表明，在不同60Co-γ剂量辐照处理下，方竹种子的萌发进程受到了不同程度的抑制。在萌发试验的第5天，对照组(ck)和低剂量处理组(10 Gy和20 Gy)的种子开始萌发，而高剂量处理组(30 Gy、40 Gy)和50 Gy处理的种子则分别在第8天和第11天开始萌发。同时，ck在第14天种子萌发结束，10 Gy和20 Gy的处理在第16天结束；高剂量处理40 Gy和50 Gy在第12天种子萌发结束。

图1 不同60Co-γ剂量辐照下方竹种子萌发进程

种子发芽率和发芽势的高低可反映种子生命活力的大小。不同60Co-γ剂量辐照后，方竹的种子发芽率和发芽势受到了不同程度的抑制。当剂量为10 Gy时，发芽率为24.67%，发芽势为22.00%，分别是ck(44.00%和38.00%)的0.561倍和0.579倍；当剂量为20 Gy时，种子的发芽率为10.67%，发芽势为8.67%，分别是ck的0.242倍和0.228倍。这说明从发芽率和发芽势的角度而言，方竹的60Co-γ辐照半致死剂量介于10～20 Gy之间。随着辐照剂量的持续提高，各处理组的种子发芽率和发芽势均极显著下降。当辐照剂量达到50 Gy时，种子的萌发率和发芽势仅为2.67%和0.67%。同时，种子相对发芽率、发芽指数和活力指数可综合反映种子的萌发情况与生长状况，是判断种子萌发能力的重要指标。结果(表1)表明，3个指标均随着60Co-γ辐照剂量的增加而呈现降低的趋势，且与对照组相比均极显著降低。

表1 不同60Co-γ剂量辐照下方竹种子相对发芽率、发芽指数和活力指数

剂量/Gy相对发芽率/%发芽指数活力指数ck100.000a2.575±0.136a25.492±1.391a1057.230±11.919b1.349±0.248b4.985±0.895b2024.717±4.866c0.509±0.042c1.321±0.275c3018.065±2.623d0.354±0.094d0.409±0.120d4010.939±3.433e0.214±0.046e0.181±0.039e506.042±1.929f0.105±0.039f0.019±0.004f

图2 不同60Co-γ剂量辐照下方竹种子发芽率和发芽势

2.3 不同60Co-γ剂量辐照对方竹幼苗生长的影响

辐照胁迫对植物种子萌发芽长、根长的影响可以反映植物的早期抗逆性[10,17]。结果(图3)表明，随着辐照剂量的不断提高，方竹幼苗的根和芽的生长受到了明显的抑制，其根长和芽长极显著降低。ck幼苗的根长为9.90 cm，芽长为4.85 cm。当辐照剂量为10 Gy时，幼苗的根长和芽长分别为3.70 cm和2.60 cm，比ck短了6.20 cm和2.25 cm。随着剂量的继续提升，根、芽也继续变短。剂量为30 Gy时，根长只有1.15 cm，芽长为1.64；当剂量达到最高的50 Gy时，幼苗的生长受到严重的抑制，根和芽长度分别只有0.19 cm和0.33 cm(图4)。

图3 不同60Co-γ剂量辐照下方竹幼苗的根长和芽长

图4 不同60Co-γ剂量辐照下方竹萌发后的幼苗

根冠比可反映植株在生长发育过程中受到逆境胁迫的程度。试验发现，ck幼苗的根冠比为2.04；随着辐照剂量的提高，处理组根冠比依次为1.42、1.51、0.70、0.94和0.58。根冠比随着剂量的提高而呈下降的趋势。当辐照剂量小于或等于20 Gy时，根冠比大于1.0，最小为1.51；而剂量大于等于30 Gy时，根冠比小于1.0；剂量为50 Gy时，根冠比仅为0.58。这表明高剂量严重抑制了根和芽的生长发育。实验表明，ck组长出根和芽的幼苗，大部分都能正常生长，成苗率极高；而处理组除了10 Gy有5株正常生长外，其余处理组的幼苗均无法正常生长。这也表明方竹种子经过辐照处理后，萌发的种子成苗率极低。这不仅和辐照有关，可能也与种子的质量、幼苗的管理水平等有一定关系。

3 讨 论

竹子的进化经历了漫长的过程，在约4 200万年前开始分化形成草本竹和木本竹，最终形成不同的单系类群或多系类群的属[2,18]。漫长的进化历程使其适应特殊的生长环境，形成营养周期长、结实率低的独特生长发育习性，给杂交育种带来了挑战。辐照育种已应用于澳洲坚果、瓜尔豆、洋紫荆、小麦等植物[13,14,19,20]，在竹类植物方面多集中在毛竹的应用[21,22]。本研究结果表明，60Co-γ辐照处理不同程度地影响了方竹种子的萌发特性；随着辐照剂量的提高，相较于ck，处理组方竹种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等萌发特性指数均极显著降低。这与李洁等[10]、蔡春菊等[22]的研究结果相类似，表明辐照处理影响了植物种子的萌发。同时，60Co-γ辐照处理使方竹种子的萌发起始日期推迟，并且提前结束萌发；尤其是高剂量处理推迟了4～5 d，却提前2～3 d结束萌发。赵东晓等研究发现，60Co-γ辐照延迟了胡麻种子的萌发起始日期[12]；蔡春菊等[22]利用60Co-γ辐照毛竹种子，处理组的毛竹种子萌发进程也往后延迟。这可能是辐照后，种子内部的自由基和酶活性发生变化，种胚组织受损，进而影响细胞的生长和分裂，萌发进程受阻[12]。

不同植物或同一植物的种子，因其遗传背景、成熟度、含水量、内含物、大小、种皮厚度等内外因素的差异，导致对辐照剂量的承受有较大的差异[12]。在适度的范围内，随着辐照剂量的增加，材料的突变率、突变谱将会逐渐提高和拓宽；但超过临界剂量后，随着辐照剂量的继续增加，材料的发芽率、成活率、成苗率将极大降低，而畸变率则增加[12,14]。洋紫荆种子60Co-γ辐照处理的剂量介于0～375 Gy之间，致死剂量为375 Gy[14]；胡麻的介于0～12 000 Gy之间，但半致死剂量为5 716～6 668 Gy[12]；乌拉尔甘草的介于0～300 Gy之间[17]；澳洲坚果的介于0～200 Gy之间[13]；而毛竹的辐照剂量则为0～400 Gy，临界剂量和半致死剂量之间的范围为100～175 Gy，这可作为毛竹种子诱变处理的最佳辐照剂量范围[22]。本试验的方竹种子，60Co-γ辐照处理剂量为0～50 Gy；当剂量为20 Gy时，方竹种子的发芽率和发芽势急剧下降，分别为10.67%和8.67%，是ck的0.242倍和0.228倍；可见方竹的辐照半致死剂量应该介于10～20 Gy之间。与上述不同科、属植物相比，方竹种子耐辐照剂量范围较窄；与同亚科的竹类植物毛竹相比较，其半致死剂量也相对极低。同时，辐照的剂量率也影响种子的萌发和成苗。郑丹菁等研究不同剂量率和辐照时间对洋紫荆种子的萌发和幼苗生长发现，在同一辐照剂量水平下，随着剂量率的提高，洋紫荆出苗率和成苗率均呈现下降的趋势[14]。进一步比较发现，胡麻的剂量率为10 Gy·min-1，洋紫荆的剂量率为0.5、1.0、1.5、2.0 Gy·min-1，乌拉尔甘草的剂量率为2.67 Gy·min-1，毛竹的剂量率为1.90 Gy·min-1[12,13,17,22]，而本试验的方竹剂量率为1.40 Gy·min-1。就理论上而言，本试验处理方竹的辐照剂量低、剂量率小，其萌发率、成苗率、突变率等应较为可观，但结果表明，方竹没有低剂量刺激效应，且其成苗率极低(除了10 Gy处理可成苗外，其余处理的幼苗均不能正常生长)。张桂莲等研究表明，水稻种子的发芽率、发芽势、活力指数、成苗率等特性与种子的成熟度呈正相关[23]；兰科[24]植物、泡桐种子[25]也呈现类似的结果。而本试验对照组的方竹种子萌发率、发芽势、发芽指数和活力指数分别为44.00%、38.00%、2.575和25.492，某种程度上表明方竹种子的成熟度、含水量、内含物均未达到最佳状态。这可能导致方竹种子表现出对60Co-γ辐照极为敏感。

辐照诱变技术在新种质资源创制、农作物新品种培育等方面得到了广泛的应用[26]，也培育出一系列的优异种质资源，如低镉积累的稻米品种，玉米、大豆、大麦等低值酸突变体[27,28]。辐射育种不仅为新品种同质化严重、亲本资源遗传基础狭窄问题提供了解决途径, 也有望在解决育种工作中某些特殊问题方面取得突破[11]，如笋用竹、浆用竹、材用竹等功能型用竹的育种。本试验初步研究笋用竹方竹对60Co-γ辐照的响应，初步得到了低剂量的幼苗，这为从DNA、RNA及蛋白水平研究其诱变机制和分子标记辅助育种提供材料，也为后续浆用竹、材用竹的新种质创制提供参考。目前，国家加大了对诱变育种研究的支持力度，通过辐照诱变而培育出笋用竹、浆用竹、材用竹等功能型竹类植物新种质和新品种，尤其是高纤维素、低木质素的笋浆两用竹，不仅可满足生产对原材料的需要，还可减排降耗，推动以竹代木、林纸一体化的建设。