云南佤族和布朗族人群药物基因组学基因遗传差异

代 润，张 婵，程瑜静，陈婉璐，李 琦，王玉明

（1） 云南省第一人民医院输血科，云南昆明 650100；2） 昆明医科大学第二附属医院检验科，云南昆明 650101）

随着医学的不断发展，医学知识、技术与科学数据正处于前所未有的融合阶段，对患者治疗方式的选择就变得极其重要。个性化医疗正是基于这一点，综合考虑每个患者的特点，选择最适合个人的最佳治疗方法。其范围更加广泛，包括药物基因学、药物基因组学等。其中，药物基因组学是识别个体对特定药物反应中起作用的基因变异，包括剂量需求、疗效和药物不良反应风险的差异[1]。近年来，大量药物基因组学研究主要集中在与药物动力学或临床相关药物的药效学相关的VIPs（Very important drug genes） 上[2]，它们主要在药物的吸收、分布、代谢、消除，以及药物的分子靶点/通路中发挥至关重要的作用[3-4]。

目前人们对药物基因组学不断深入的研究，研究者发现与药物反应相关的基因变异在不同的种族中是不同的[5-7]。中国是个人口大国，拥有56 个民族，其中，云南省是我国少数民族最多的省份，云南特有的少数民族中佤族约43 万人口，布朗族约11 万人口。虽然人类基因组计划研究了全球人口样本，但许多少数民族的药物基因组学信息仍然是未知的。

笔者研究了云南佤族和布朗族VIP 位点的基因型和等位基因频率分布，并且将佤族和布朗族分别和其他8 个种群进行比较，以评估等位基因频率的差异。研究结果为进一步完善药物基因组学数据库信息，了解药代遗传及其多样性提供初步的依据，更好地了解佤族和布朗族人群的进化历程，为更安全的药物给药和今后云南省开展合理的个体化健康管理提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

从云南省随机招募了200 名无亲缘关系的健康人，其中佤族100 名，布朗族100 名。每个参与者都经过了严格的调查，在三代以内均是相同的种族，且无任何疾病。近年来虽然受汉族的影响较大，但是他们与其他民族之间的交流较少，仍然保持了各自民族独特的特点。所有参与者对本研究的实验方案已知悉并签署知情同意书，且该研究得到云南省第一人民医院伦理委员会审批通过。另外，该研究方案符合卫生与公众服务部（department of health and human services，DHHS） 关于人体研究课题保护的规定。

1.2 位点选择和基因分型

笔者搜索了PharmGKB 数据库（https://www.pharmgkb.org/） 并从中选取了40 个位点进行研究。根据全血基因组DNA 纯化试剂盒的说明书，笔者从参与者的血液中提取基因组DNA，采用NanoDrop 2000C 分光光度计测定DNA 浓度。

使用Agena MassARRAY 阵列设计软件对单核苷酸多态性（SNP） 位点进行引物设计[8]，并使用Agena MassARRAY RS1000 软件进行基因分型，最后用Agena Typer 4.0 软件进行数据收集。

1.3 群体遗传结构分析

此外，笔者使用Arlequin 软件和Structure2.3.4软件来观察9 个民族的人群结构。首先，在贝叶斯聚类算法的基础上，笔者进行了群体结构分析，将样本分配到假设的K 个种群内。其中，每个个体都是由一个垂直的列来表示的，这些列被分割成不同的颜色部分。其次，Fst 值是在种群和进化遗传学中应用最广泛的描述性统计。运用Arlequin 软件分别完成了佤族和布朗族与其他8 个种族的Fst值的计算，以推断群体中两两之间的距离。

1.4 统计学处理

用SPSS 软件于检测每个VIP 位点的频率是否符合哈德-温伯格平衡定律，如符合，进一步对佤族和布朗族进行了VIP 位点的基因型频率等检测，并依据千人基因组计划数据库分别将佤族和布朗族与其他8 个种族通过卡方检验进行基因型频率比较，包括（1） 东亚： CHS（中国南方汉族），KHV（胡志明市越南人）；（2） 南亚：BEB（孟加拉国的孟加拉人）；（3） 欧洲：GBR（英格兰和苏格兰人）；（4） 美国：CLM（哥伦比亚麦德林的哥伦比亚人）；（5） 非洲：ACB（在巴巴多斯的非洲加勒比海人），GWD（冈比亚西部地区的冈比亚人）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VIP 位点的基本信息

所选40 个VIP 位点（其中有10 个位点不符合哈德-温伯格平衡定律，已将其剔除。） 在佤族和布朗族中的基本信息，包括SNP_ID 号、基因名称、位置、核苷酸变化、功能变化、等位基因等，见表1。

2.2 佤族与其他8 个人群中的基因型频率比较分析

佤族人群的基因型频率分布和其他8 个人群的基因型频率分布比较的p值结果如表2 所示。笔者发现，校正前，与中国云南布朗族、CHS、KHV、BEB、GBR、CLM、ACB、GWD 群体分别进行比较，中国云南佤族分别有3，5，10，15，18，18，26，22 个不同的VIP 位点。Bonferroni 校正后，中国云南佤族分别有0，2，0，10，11，9，15，17 个不同的VIP 位点。VDR rs11568820（P=0.002，P=9.3E-06，P=1.0E-04，P=2.3E-04，P=9.3E-13，P=1.2E-13，P=1.1E-05 和P=4.7E-11） 和COMT rs4680（P=0.172，P=0.005，P=0.034，P=3.3E-09，P=1.8E-12，P=5.0E-06，P=4.2E-04 和P=0.026） 在中国云南佤族人群中表达较其他8 个群体有显著差异。而rs6791924（P=1.3E-06 和P=5.8E-08），rs2066702（P=9.7E-09 和P=6.4E-07），rs1138272（P=5.8E-04）、rs59421388（P=2.1E-04） 和rs61736512 （P=2.1E-04） 的显著性差异较小。

表1 VIP 位点的基本信息（1）Tab.1 The basic information of VIP variants（1）

2.3 布朗族与其他8 个人群中的基因型频率比较分析

布朗族人群的基因型频率分布和其他8 个人群的基因型频率分布比较的P值结果如表3 所示。校正前，与中国云南佤族、CHS、KHV、BEB、GBR、CLM、ACB、GWD 群体分别进行比较，中国云南布朗族分别有3，7，10，17，20，19，25，24 个不同的VIP 位点。Bonferroni 校正后，中国云南布朗族分别有0，4，1，11，11，11，16，18 个不同的VIP 位点。NR1I2 rs3814055 在中国云南布朗族人群中表达较其他8 个群体有显著差异（P=0.004，P=7.3E-06，P=0.008，P=2.7E-09，P=9.0E-13，P=1.1E-14，P=2.9E-13，和P=2E-11），而 rs6791924（P=1.3E-06 和P=5.8E-08），rs2066702（P=9.7E-09 和P=6E-07），rs1138272（P=5.8E-04）、rs59421388（P=2.1E-04） 和rs61736512（P=2.1E-04） 的显著性差异较小。

表1 VIP 位点的基本信息（2）Tab.1 The basic information of VIP variants （2）

2.4 群体遗传结构分析

为进一步鉴定9 个群体之间的祖先群体关系，笔者利用基于结构计算的基于模型的聚类方法进行了分析（K=3-9），如图1 所示。随着K 值的增加，亚组间的差异更加明显。而K=3 被认为是最适当的值，可以将这些个体明确地分为三个祖先亚群，分别为：亚组1（中国云南布朗族、中国云南佤族、CHS、KHV），亚组2（BEB、GBR、CLM），亚组3（ACB、GWD）。结果表明，东亚地区的布朗族、佤族、CHS、KHV 人群的遗传结构相似，此结果在表1 中得到了证实。

表2 佤族与其他8 个人群中的基因型频率比较分析Tab.2 The comparative analysis of genotype frequency between Wa and other 8 populations

基于遗传结构，进一步利用两两配对的Fst 值来评价9 个群体之间的遗传关系（表4）。从表4中发现，中国云南布朗族、中国云南佤族与东亚地区的CHS、KHV 人群的Fst 值较小。Fst 值越小，人群遗传结构越相似。结果表明，布朗族与佤族的关系最接近（Fst=0.003），其他种群次之。

3 讨论

近年来发展的药物基因组学通过关联患者个体的遗传物质与药物的药动学、药效学特性，可以帮助医师、药师预测药物疗效、估算药物剂量、调整给药方案以及预防药物不良反应发生，指导个体化合理用药[9]。云南地区针对少数民族基因多态性的研究主要关于STR 基因座[10]，对药物基因的多态性研究并不多见，朱柯颖等[11]人对云南彝族人群CYP4A11 rs9333025 基因A/G 多态性的分布进行过研究。在本次研究中，笔者对中国云南佤族和布朗族人群的VIP 位点进行了基因分型和等位基因频率分布检测，并将中国云南佤族和中国云南布朗族分别和其他8 个种群进行比较，对等位基因频率的差异进行了评估。数据分析结果显示，云南佤族与东亚地区的布朗族、CHS、KHV 的差异较小，而与其他地区的人群差异较大，尤其是非洲地区的人群。云南佤族与其他8 个人群比较，最为显著的位点是VDR rs11568820 和COMTrs4680。云南布朗族与东亚地区的佤族、CHS、KHV 的差异最小，而与南亚、欧洲、美国、非洲地区的人群差异较大，尤其是非洲地区的人群。布朗族与其他8 个人群比较，最为显著的位点是NR1I2 rs3814055，此结果与笔者以前的研究结果一致[12]。

表3 布朗族与其他8 个人群中的基因型频率比较分析Tab.3 The comparison and analysis of genotype frequency between Blang and other 8 populations

图1 9 个群体的遗传结构分析Fig.1 Genetic structure analysis of 9 populations

表4 9 个种群的Fst 值Tab.4 Fst values among 9 populations

VDR（Vitamin D （1，25-dihydroxyvitamin D3） receptor，维生素D 受体） 基因定位于染色体12q13.11，是维生素D 途径的重要调控因子，在该基因中发现了许多常见的SNP 位点。Rs11568820位于VDR 基因的5' 调节区域，rs11568820 等位基因A 被Rowland 等人发现侵袭性前列腺癌的风险增加有关[13]。一项由卫生专业人员进行的随访研究指出，25（OH） D 缺乏与前列腺癌风险呈负相关的关系，而Mikhak 等[14]发现，携带rs11568820 位点A 等位基因的男性，如果缺乏25（OH） D 基因，那么其患前列腺癌的风险将显著降低。这些趋势上的差异可能是由于种族差异造成的，因为研究是在所有美国男性的人群中进行的，而卫生专业人员的后续研究主要在欧洲男性人群中进行的。

COMT（Catechol-O-methyltransferase，儿茶酚-邻甲基转移酶） 是一种重要的雌激素代谢物结合失活的雌激素代谢酶[15]，由位于22q11 号染色体上的COMT 基因编码。COMT 在多种人体组织中的表达量都很高，包括卵巢、乳腺、肝脏和肾脏组织。近日，有研究者发现，COMT rs4680 上的单个碱基的改变导致缬氨酸替代了蛋氨酸，被认为是使COMT 活性降低了3-4 倍的原因[16]。近年来这种酶被发现在受激素影响的癌症的发展中起着至关重要的作用，例如，乳腺癌[17-19]，。Wan 等人的一项荟萃分析表明，COMT rs4680 位点可能会增加中国人群乳腺癌的易感性，特别是在绝经前的妇女人群中[18]。Lin 等人在总体分析中发现COMT rs4680 多态性与子宫内膜癌风险无显著相关性，但在GA/GG 和（AA+GA）/GG 遗传模型下，绝经后妇女人群中发现的风险显著降低[17]。He 等[19]的研究表明COMT 基因多态性与降低白种人乳腺癌风险有关，而与其他人群无关。这些结果可能提示绝经状态和种族差异对COMT rs4680 多态性与激素相关癌症（包括卵巢癌） 的相关性有重要影响。

NR1I2（Nuclear receptor subfamily 1 group I member 2） 属于核激素受体超家族，其主要作用是作为转录因子促进药物和有毒外源性药物的解毒和清除。Rs3814055 定位于NR1I2 的5’非翻译区，在疾病风险的预测和药物基因组学方面均已经引起了许多研究者的关注。大量研究表明，NR1I2 基因中rs3814055 的频率在不同人群中是不同的。在中国汉族人群中该位点的频率为0.218[5]，欧洲人为0.500[20]。有研究发现在珞巴族和苗族中该位点的T等位基因的频率分别是0.101 和0.090[6-7]。在本研究中佤族和布朗族中rs3814055 的T 等位基因的频率分别是0.840 和0.060。以上的研究再一次充分说明了等位基因频率的分布受到了种群的影响。希望笔者的数据能够补充药物基因组学数据库。

药物基因学和药物基因组学知识库（PharmGKB:http://www.pharmgkb.org） 是解释基因-药物-疾病关系的极其有用的资源，拟在揭示这些遗传变异与药物反应之间的关系，为患者提供最合适的药物类型和准确的最佳剂量指导，从而提高药物的疗效和安全性，是开发个性化药物和患者药物管理的重要基础。然而，种族对药物反应的差异很大，目前部分少数民族相关的研究还不够充分。希望本研究的数据能够补充佤族和布朗族的药物基因组学信息，为其更安全的用药以及新药的开发提供一定的理论依据，并为个性化医疗的发展提供一些帮助。