不同条件下工业大麻中大麻二酚含量变化

孙孔春 ，陈兴龙，杨璨瑜，于浩飞，胡炜彦，王 蕊，沈报春，张荣平

（1） 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室；2） 法医学院，云南昆明 650500；3） 云南中医药大学中药学院，云南昆明 650500）

工业大麻（Cannabis sativa L.） 为一年生草本植物，又名大麻、汉麻、火麻[1]，主要应用于食品、制药、纺织、化妆品等行业。其中的大麻二酚（CBD） （结构式见图1） 是大麻中的非毒性和非成瘾性成分，能阻碍THC 对人体神经系统的不利影响，是大麻酚类物质中最重要的生理活性成分之一，据文献报道，其对于抗焦虑，镇痛、抗失眠、阿尔茨海默病和抗惊厥[2-7]等有一定疗效。在工业大麻产业合法化的同时，分析测定大麻二酚的含量并考察其在提取前处理过程中不同条件对其含量变化的影响，对于在工业生产中大麻二酚的提取具有极其重要的意义。

本文建立了HPLC 分析测定CBD 含量的方法，考察CBD 在工业大麻不同部位，不同烘烤温度，不同烘烤时间，不同PH 条件等前处理条件下CBD的含量变化，为工业生产提供技术依据。

图1 大麻二酚结构式Fig.1 The structural formula of Cannabidiol

1 材料与方法

1.1 实验仪器

岛津LC-2010A 高效液相色谱仪，岛津SPD-M10AVP 检测器，岛津LC solution 色谱工作站；色谱柱：InertSustain C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；电子天平（BSA124S）：北京赛多利斯科学仪器有限公司；超声清洗仪（SK3200H）：上海科导超声仪器有限公司；0.22 μm 尼龙微孔滤头：天津市津腾试验设备有限公司；一次性使用无菌注射器5 mL、2.5 mL：陕西龙康鑫医疗器械有限公司；20 μL、100 μL、200 μL 及1 000 μL移液枪：Eppendorf Research plus。

1.2 实验样品及试剂

甲醇（分析纯，江苏汉邦科技有限公司）、超纯水（超纯水仪，倍捷科技有限公司），大麻二酚对照品（西安百川生物科技有限公司生产）；工业大麻（云麻七号，云南森牧源生物科技有限公司）。

1.3 对照品及供试品溶液的制备

1.3.1 对照品溶液的配制 取CBD 对照品适量，精密称定，用甲醇配成浓度为100 μg/mL 对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液的配制 分别称取各大麻供试品约0.2 000 g，于试管中加入约8 mL 正己烷-乙酸乙酯（V/V 9:1） 溶液，超声5 min，静置90 min，离心15 000 r/min，10 min，收集上清液至10 mL 容量瓶中，定容，摇匀，备用。

1.4 方法学研究

1.4.1 色谱条件 色谱柱：InertSustain C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：220 nm；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；以甲醇-水（85：15） 为流动相进行等度洗脱。在此色谱条件下，取CBD 对照品和工业大麻样品分别进样分析。

1.4.2 线性关系的考察 精确称取CBD 对照品，照1.3.1 下方法配制得到100 μg/mL 的对照品溶液，再按1.4.1 下色谱条件分别进样1、5、10、20、50 μL，记录保留时间和峰面积。

1.4.3 精密度和重复性试验 精密吸取1.3.1 下方法配制的同一份供试样品溶液，按1.4.1 下色谱条件连续进样6 次，记录CBD 保留时间及峰面积；取同一份供试药材工业大麻，按1.3.2 下方法平行操作制备5 份样品，分别按1.4.1 下色谱条件进样，记录CBD 保留时间及峰面积，计算各物质保留时间和峰面积的RSD%，分别考察该方法的精密度和重复性。

1.4.4 稳定性试验 按1.3.2 下方法配制供试样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 按1.4.1 下色谱条件进样10 μL 测定，记录CBD 保留时间及峰面积，计算各物质的保留时间和峰面积的RSD%。

1.4.5 加样回收率 向已知大麻二酚含量的工业大麻样品供试品中，精密加入一定量的CBD 对照品，计算实测值与供试品中含有量之差，再除以加入对照品量计算回收率。

1.5 样品含量测定

取分别经不同烘烤温度，不同烘烤时间，不同PH 处理后的工业大麻样品，按1.3.2 下方法配制成供试品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色谱仪，记录保留时间及峰面积，将所得结果带入CBD 标准曲线，计算工业大麻样品中CBD 的含量。

2 结果

2.1 方法学研究结果

2.1.1 工业大麻中CBD 及样品HPLC 色谱图 按1.3.1项下方法配制对照品溶液，按1.4.1 下色谱条件进样，记录CBD 对照品色谱图（图2）；按1.3.2项下方法配制供试品溶液，取按1.4.1 下色谱条件进样，记录工业大麻样品色谱图（图3）。

图2 CBD 对照品色谱图Fig.2 The chromatogram of cannabidiol reference substance

图3 工业大麻样品色谱图Fig.3 The chromatogram of Industrial hemp sample

2.1.2 线性关系 按1.4.2 下方法操作，将结果以质量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得到CBD 线性回归方程为：Y=4×106x+17126，相关系数R2=0.9990，在0.000 1～0.005 mg 范围内线性关系良好。

2.1.3 精密度试验和重复性试验 按1.4.3 下方法操作，记录峰面积，精密度实验计算得到工业大麻中CBD 峰面积的RSD%为0.11%，结果表明仪器精密度和操作精密度良好；重复性实验计算得到工业大麻中CBD 峰面积的RSD%为0.41%，符合规定，结果表明方法重复性良好。

2.1.4 稳定性试验 按1.4.4 下方法操作，记录峰面积，稳定性实验计算得到工业大麻中CBD 峰面积的RSD%为0.88%，结果表明样品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.5 加样回收率 按1.4.5 下方法操作，记录峰面积，计算得到工业大麻中CBD 峰加样回收率，具体结果见表1，加样回收率在范围内，结果表明方法准确度可靠。

2.2 含量测定结果

按1.5 下方法操作，记录保留时间及峰面积，将所得结果带入CBD 标准曲线，计算经不同烘烤温度，不同烘烤时间，不同pH 条件处理后工业大麻中CBD 的含量，结果表明：工业大麻的大麻叶子中CBD 含量较高，且在120 ℃条件下，烘烤40 min 条件下能够明显提高大麻叶中CBD 的含量，强碱条件对CBD 的稳定性造成影响。具体结果详见表2～7，大麻叶在不同烘烤温度下CBD 含量变化见图4。

进一步细化时间点，采取直接放入样品再升温烘烤或者升温后再放入样品烘烤两种方式，以5 min 为时间单位，在不同的时间点取样，测定CBD含量，结果表明：两种烘烤方式对大麻叶中CBD含量影响不大，在40 min 时用CBD 含量较高，详细结果见表5～6。

取约1 mg CBD 样品，加乙醇溶解，分别用盐酸和氢氧化钾调节pH 为1，7，和11，放置0，5 和15d 考察不同pH 值对CBD 含量的影响，结果见表7。

表1 加标回收率试验结果Tab.1 The result of recovery rate test

表2 大麻叶、种子以及茎中CBD 含量测定结果Tab.2 The results of CBD determination in cannabis leaves，seeds and stems

表3 大麻叶在不同烘烤温度下CBD 含量测定结果Tab.3 The results of CBD determination of cannabis leaves at different baking temperatures

表4 大麻叶在120 ℃时的不同烘烤时间下CBD 含量测定结果Tab.4 The results of CBD determination of cannabis leaves at different baking times at 120℃

表5 直接放入大麻叶样品再升温至120 ℃烘烤后的不同时间点下CBD 含量测定结果Tab.5 The results of CBD content measurement at different time points after the cannabis leaf samples were directly placed and heated to 120 ℃

表6 升温至120 ℃再放入大麻叶样品烘烤后的不同时间点下CBD 含量测定结果Tab.6 The results of determination of CBD content at different time points after heating to 120 ℃and placing in cannabis leaf samples after baking

表7 CBD 在不同pH 条件以及不同放置时间下的含量测定结果Tab.7 The determination results of CBD under different pH conditions and different storage times

图4 大麻叶在不同烘烤温度下CBD 含量变化图Fig.4 The changes of CBD content in hemp leaves at different baking temperatures

3 讨论

由表2 可得：工业大麻的大麻叶、种子以及茎中CBD 含量差别较大，在CBD 提取过程中应该选取叶子，尽量避免掺入种子和茎。

由表3 可得：将工业大麻叶在不同温度下烘烤30 min，测定其中CBD 的含量，研究结果表明以一定的温度对大麻叶进行烘烤能够提高大麻叶中CBD 的含量，并且以120 ℃的温度进行烘烤含量提高最明显。

由表4 可得：将工业大麻叶在120 ℃的条件下，选择不同烘烤时间，对其CBD 含量进行测定，发现在烘烤40 min 的时候CBD 含量最高，说明烘烤时间对CBD 的含量造成了一定影响。

由表5、表6 可得：采取直接放入样品再升温烘烤或者升温后再放入样品烘烤两种方式，以5 min 为时间单位，在不同的时间点取样，发现两种烘烤方式对大麻叶中CBD 含量影响不大，均在40 min 时用CBD 含量最高。以上研究结果表明在120℃条件下，烘烤40 min 能够明显提高大麻叶中CBD 的含量。

由表7 可得：测定结果表明pH 值会对CBD的稳定性造成影响，且强碱性条件的影响更为明显，随着时间的推移，CBD 逐渐降解。

本实验参考大麻二酚含量测定的相关文献[8]，建立HPLC 法测工业大麻中大麻二酚的含量，由图2 可以看出，大麻二酚保留时间为8.982 min，该法可简单、快速测定工业大麻中大麻二酚的含量。

大麻二酚在大麻叶中含量较高，于烘烤温度为120 ℃时，烘烤40 min 条件下能够明显提高大麻叶中CBD 的含量，且大麻二酚在强碱性条件下易降解为其它物质，本实验为工业中提取大麻二酚处理过程提供技术依据。